缺血后处理对大鼠再灌注损伤肺细胞凋亡的影响*

石 璐，贾旭广，罗 岷，刘亚坤，赵 珊，陈海娥，马迎春，陈 丹，王万铁△

近年来，随着心胸外科手术的广泛开展，肺动脉袖状切除、肺移植、心肺联合移植、肺溶栓治疗等新的医疗方法不断建立和发展，但肺缺血／再灌注损伤（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）始终是影响溶栓及移植后预后的一个重要因素。但迄今为止，LIRI的发生机制尚未完全阐明，有研究证实肺缺血再灌注损伤诱导了细胞凋亡［1］。

缺血后处理（ischemic postconditioning，IPostC）即长时间缺血后再灌注前短时间内反复短暂再缺血处理，可调动机体内源性保护机制，明显减轻缺血组织的缺血／再灌注损伤［2］。近年来有研究发现 IPostC对肺组织具有保护作用［3］，但对这种保护作用的观察主要集中在生化指标的改变，而IPostC对LIRI时肺组织细胞凋亡影响的研究鲜有报导。本研究在大鼠LIRI模型上观察IPostC对LIRI过程中细胞凋亡及其相关基因影响，并探讨其作用机制，为临床防治LIRI提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性成年SD大鼠24只，体重（220～250）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（许可号：2007-0005）。MDA、SOD、MPO试剂盒购自南京建成公司，Bcl-2、Bax鼠多克隆抗体购自美国santa cruz公司，In Situ Cell Death Detection Kit购自瑞士Roche公司，Trizol购自美国invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒购自美国fermentas公司，PCR mix购自天根公司。PCR引物由上海捷瑞合成。Bcl-2引物序列：上游：5’-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3’下游：5’-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’；Bax引物序列：上游：5’-ATTGGAGATGAACTGGACAAT-3’下 游：5’-CCACAAAGATGGTCACTGTC-3’；β-actin引物序列：上游：5’-CCAGCCATGTACGTTGCTA TCCAG-3’下游：5’-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA-3’。

1.2 动物模型的制备及分组

实验大鼠随机分为 3组（n＝8）：（1）对照组（control，C组）：左肺门游离后留置阻断带，观察150 min；（2）肺缺血／再灌注组（lung ischemia reperfusion，I／R组）：阻断左肺门30 min后开放再灌注120 min；（3）肺缺血／再灌注 ＋缺血后处理组（ischemic postconditioning，IPostC组）：阻断左肺门30 min后给予连续的缺血30 s／再灌注30 s后处理循环3次后再灌注120 min。

1.3 血清指标检测

实验完毕各组动物于颈动脉取血约2 ml，注入空白离心管中，于4℃3 000 r／min离心10 min后取上清即为血清。取各组大鼠血清按试剂盒说明书操作，检测血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性及含量。

1.4 原位缺口末端标记法（TUNEL）测定肺组织细胞凋亡

每只大鼠取1张肺组织石蜡切片，脱蜡水化后蛋白酶 K（10μg／mg）37℃消化 20 min；加 TUNEL restion mixture 50微升／片，37℃反应 60 min；加 Convert-POD 37℃反应 30 min；3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色；苏木素复染。计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数。凋亡指数（apoptosis index，AI）＝检测到的凋亡细胞数÷5个高倍视野检测到的细胞总数×100%。

1.5 肺组织Bcl-2、Bax免疫组化分析

肺组织切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶；复合消化液暴露抗原，封闭非特异性抗原后滴加1∶100稀释的Ⅰ抗，37℃1 h，阴性对照为PBS替代I抗；滴加生物素化Ⅱ抗IgG，37℃20 min；滴加SABC，37℃20 min；DAB显色3 min，然后苏木素复染、脱水、透明、封片。镜检：显色呈棕黄色为阳性表达。应用美国 IPP6.0（Image-pro plus）彩色图像分析系统测定吸光度（optical density，OD）值。

1.6 RT-PCR测定肺组织Bcl-2、Bax mRNA的表达

用Trizol一步法提取肺组织总RNA，逆转录cDNA的过程参照试剂说明书进行。PCR反应体积12.5μl：cDNA 2.5μl，上下游引物各 0.25μl，PCR mix 6.25μl，双蒸水补足体系。反应条件：94℃变性5 min，然后以94℃30 s，退火 Bcl-2为66℃ 45 s，Bax为55℃ 45 s，延伸72℃45 s，循环次数：Bcl-2为30次，Bax为 35次，最后 72℃ 7 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色后，用凝胶成像及定量扫描仪测得。用gelpro analyze分析软件分析电泳图，用内参β-actin的灰度值校正计算Bcl-2、Bax mRNA的相对含量。

1.7 统计学处理

计量资料均进行正态性检验，以均数±标准差（¯x±s）形式表示，采用 SPSS 16.0软件进行统计分析。多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet’s t检验。双变量相关性分析，采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。

2 结果

2.1 氧化-抗氧化系统检测结果

与C组比较，I／R组血清SOD活性显著降低；MDA含量和 MPO活力显著升高（均 P＜0.01），IPostC组与 I／R组相比，MDA含量显著降低（P＜0.05），MPO活力显著降低（P＜0.01），SOD活性升高（P＜0.01，表 1）。

2.2 肺组织原位细胞凋亡检测结果

肺组织原位细胞凋亡检测示，I／R组凋亡指数（39.03±3.46）显著高于 C组（2.88±0.34），IPostC组 AI（8.03±0.88）显著低于 I／R组（均 P＜0.01）。凋亡细胞主要为肺泡上皮细胞与血管内皮细胞（棕黄色凋亡细胞颗粒）（表2，图1，见彩图页Ⅲ）。

Fig. 1 Apoptotic cells in lung tissue of each group（DAB ×400）C：Control group；I/R：Ischemia/ reperfusion group；IPostC：Ischemic postconditioning group

Tab.1 Changes of the content of MDA and the activity of MPO，SOD in serum of rat in different groups（¯x±s，n＝8）

Tab.2 Comparision of apoptosis index in lung tissue of rats by TUNEL among groups（%，¯x±s，n＝8）

2.3 肺组织Bcl-2、Bax免疫组化检测结果

肺组织Bcl-2、Bax蛋白表达呈棕黄色为阳性表达。在C组表达不明显，I／R组表达较C组明显上调，同时 Bcl-2／Bax的比值降低（均 P＜0.01，表 3）；与I／R组比较，IPostC组 Bcl-2蛋白表达增强（P＜0.05），Bax表达明显减弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均P＜0.01，图 2、图 3，见彩图页Ⅲ）。

Fig. 2 Positive expression of Bcl-2 protein in lung tissue of each group（DAB ×400）C：Control group；I/R：Ischemia/ reperfusion group ；IPostC：Ischemic postconditioning group

Fig. 3 Expression of Bax protein in lung tissue of each group（DAB ×400）C：Control group；I/R：Ischemia/ reperfusion group ；IPostC：Ischemic postconditioning group

Tab.3 Optical density of Bcl-2、Bax of lung tissues in different groups and ratio of Bcl-2／Bax protein（¯x±s，n＝8）

2.4 肺组织Bcl-2、Bax mRNA的表达

在C组表达不明显，I／R组表达较C组明显上调，同时 Bcl-2／Bax的比值降低（均 P＜0.05，表 4）；与I／R组比较，IPostC组 Bcl-2 mRNA表达增强，Bax mRNA表达减弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均 P＜0.05，图 4、图 5）。

Tab.4 Reletive amout of Bcl-2、Bax mRNA and ratio of Bcl-2／Bax mRNA in lung tissue in 3 groups（¯x±s，n＝8）

Fig.4 RT-PCR electrophoresis strip of Bcl-2 in lung tissue of each group1、4：Control group；2、5：LIR group；3、6：LIR＋ IPostC group；M：Marker；LIR：Lung ischemic reperfusion；IpostC：Ischemic postconditioning

Fig.5 RT-PCR electrophoresis strip of Bax in lung tissue of each group1、4：Control group；2、5：LIR group；3、6：LIR＋ IPostC group；M：Marker；LIR：Lung ischemic reperfusion；IpostC：Ischemic postconditioning

2.5 相关性分析

肺组织细胞凋亡指数AI与MDA、MPO呈显著正相关（P＜0.01）；凋亡指数与 SOD、Bcl-2／Bax蛋白比值、Bcl-2／BaxmRNA比值均呈显著负相关（均 P＜0.01）。

3 讨论

肺缺血／再灌注损伤可在多种临床情况下发生，包括心肺转流、肺栓塞及肺移植等。介导LIRI的病理生理机制较复杂，目前认为主要与白细胞活化、炎症介质的释放、氧自由基的产生等有关，从而导致肺泡-毛细血管屏障渗透性增高、中性粒细胞渗出、间质与肺泡水肿、组织炎症与细胞损伤等一系列病理变化，最终引起肺组织细胞的坏死或凋亡。Fischer等学者［4］发现，缺血／再灌损伤能促进供肺移植后再灌早期肺组织细胞的凋亡，过度的凋亡以导致肺功能的受损。本实验TUNEL法结果发现，对照组偶见细胞凋亡；I／R组细胞凋亡较对照组明显增加，凋亡细胞主要为肺泡上皮细胞及血管内皮细胞；相关分析结果表明肺组织细胞凋亡指数与MDA、MPO呈显著正相关，与SOD呈显著负相关。结果说明了细胞凋亡可能是LIRI的机制之一，而氧自由基的产生、中性粒细胞的聚集等多种因素参与诱导细胞的凋亡的发生。

细胞凋亡又被称为程序化细胞死亡，是细胞接受某种信号后或受到某些因素剌激后的一种主动的，由一些凋亡相关基因相互作用的细胞死亡过程。Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键作用的一类蛋白质［5］。Bcl-2是重要的抗细胞凋亡基因，在I／R损伤中表现得尤为突出。Bax基因与Bcl-2基因具有高度同源的序列，但其作用与Bcl-2基因相反，属于促凋亡基因。Bcl-2高表达时，可形成 Bcl-2／Bcl-2同源二聚体，也可形成Bcl-2／Bax异源二聚体，均起抑制凋亡作用［6］。近年来也有研究表明Bcl-2／Bax异源二聚体有助于减轻肺组织凋亡，减轻肺损伤［7］。本研究采用免疫组织化学与 RT-PCR的方法，观察到缺血／再灌注后肺组织Bcl-2、Bax表达明显上调，Bcl-2／Bax下降；且肺组织细胞AI与Bax呈正相关，而与Bcl-2／Bax比值呈负相关，提示 Bcl-2、Bax基因参与LIRI，而且再灌注后Bcl-2／Bax的比例下降是促进凋亡的重要因素。

缺血后处理作为机体一种潜在性的、内源性的保护措施，已经在心［8］、脑［9］、肾［10］等组织缺血实验中得以证实，它能使组织增加自身对缺血／再灌损伤的耐性。目前有实验亦证实，IPostC能减轻肺组织缺血／再灌损伤［3，4］，但对肺组织细胞凋亡的影响还未见报道。本实验结果发现，IPostC组细胞凋亡较I／R组明显减轻；SOD活性明显升高，MDA含量、MPO活力明显下降；Bax蛋白和Bax mRNA表达显著下调；Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA表达上调；Bcl-2／Bax的比值明显升高。而且AI与Bax呈正相关，与Bcl-2／Bax比值呈负相关，提示IPostC可能是通过减轻脂质过氧化反应，减少中性粒细胞的聚集，下调促凋亡基因Bax的表达，提高Bcl-2／Bax比值来抑制细胞凋亡，从而保护再灌注损伤肺组织的。

［1］ Stammberger U，Gaspert A，Hillinger S，et al.Apoptosis induced by ischemia and reperfusion in experimental lung transplantation［J］.Ann Thorac Surg，2000，69（5）：1532-1536.

［2］ Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic Postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：H579-588.

［3］ 李 奎，白育庭.单次与多次缺血后处理对肺缺血再灌注损伤的实验研究［J］.临床外科杂志，2008，16（5）：341-343.

［4］ Fischer S，Cassivi SD，Xavier AM，et al.Cell death in human lung transplantation：apoptosis induction in human lung during ischemic and after transplantation［J］.Ann Surg，2000，231（3）：424-431.

［5］ Ji HB，Zhai QW，Liu XY，et al.Transcription regulation of bcl-2 gene［J］.Acta Biochem Biophys Sin，2000，32（2）：95-99.

［6］ Chang TH，Liu XY，Zhang XH，et al.Effects of dlpraeruptorin A on interleukin-6 level and Fas，bax，bcl-2 protein expression in ischemia-reperfusion myocardium ［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（9）：769-774.

［7］ 邱晓晓，戴雍月，宋张娟，等.SP600125对大鼠肺缺血／再灌注损伤的保护作用及机制［J］.中国应用生理学杂志，2012，28（3）：255-258.

［8］ 高立威，谢瑞芹，崔 炜，等.不同强度及时间窗骨骼肌缺血后处理对兔心肌的保护作用［J］.中国应用生理学杂志，2012，28（1）：28-32.

［9］ Huang H，Zhang L，Wang Y，et al.Effect of ischemic postconditioning on spinal cord ischemic-reperfusion injury in rabbits［J］.Can J Anaesth，2007，54（1）：42-48.

［10］ Liu X，Chen H，Zhan B，et al.Attenuation of reperfusion injury by renal ischemic postconditioning：The role of NO［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359（3）：628-634.