间充质干细胞移植治疗急性肺损伤的研究进展

强勇 梁贵友

间充质干细胞移植治疗急性肺损伤的研究进展

强勇 梁贵友

急性肺损伤是一种临床常见的危重病症，临床上传统的治疗方法一般以尽早去除诱因、控制感染、机械通气及器官功能支持治疗为主。间充质干细胞属于成体干细胞的一种，能主动归巢至肺损伤部位，并通过向肺泡和支气管上皮细胞分化参与组织修复，同时间充质干细胞能够调节急性肺损伤时局部和全身炎症反应和免疫紊乱，从而发挥治疗作用，可能是治疗急性肺损伤的一个很有前景的方法。作者就间充质干细胞移植治疗急性肺损伤的研究进展进行综述。

间质干细胞；急性肺损伤；综述

急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是一种临床常见的危重病症，也是现代危重医学一大难题。其主要病理特点是肺上皮细胞和内皮细胞屏障广泛性受损，肺毛细血管弥漫性损伤、通透性增强，中性粒细胞涌入肺组织，肺内促炎与抗炎因子失衡。严重的ALI极易发展为急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory ditress syndrome,ARDS），以进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症为临床特征。目前临床上传统的治疗方法一般以尽早去除诱因、控制感染、机械通气及器官功能支持治疗为主，以最大限度地减少细胞损伤的数量和程度，但治疗效果未取得实质性突破，未能有效的阻止病程的发展，死亡率高达40﹪[1-2]，因此寻找新的有效治疗急性肺损伤的方法成为亟待研究的重要课题。

近年来干细胞移植技术一直是各国学者研究的热点，干细胞是一类可以自我增殖和具有多项分化潜能的细胞，目前常用的有两大类—胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞因为受到伦理学和致瘤等因素的问题，临床上难以推广。而成体干细胞不受论理学的问题且也可以多胚层分化而应用前景非常广阔。研究显示干细胞可作为疾病的观察预后的生物学标志和一种新的治疗手段，它的优势大部分在于它有归巢至组织，分化成合适的细胞及修复损伤区域的功能[3]。除此之外，越来越多的学者认为干细胞可能分泌各类细胞因子和生长因子，对于组织修复也起到了重要作用。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）属于成体干细胞中的一种，在肺损伤修复中研究最多，作为一种成体干细胞可向肺泡和支气管上皮细胞分化。因此，MSC作为多种人体组织工程的种子细胞在干细胞治疗、组织工程治疗和再生医学研究应用中具有重要的价值。本文将MSC移植治疗急性肺损伤的研究进展作一综述。

一、MSC概述及生物学特性

（一）MSC的来源和鉴定

MSC是一种来源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，也称为间充质基质细胞[4-5]。其来源较广，可以从很多组织中，包括脂肪组织、肝脏、肌肉、羊水、胎盘、脐带、脐带血、牙髓中获取。对于如何鉴定，国际细胞治疗协会（international society for cell therapy，ISCT）提出[5]：（1）纺锤形，在标准培养条件下贴壁生长；（2）细胞表面标记表达CD105、CD73和CD90阳性率超过95﹪，CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR阴性率超过95﹪；（3）体外可诱导分化为骨、软骨和脂肪细胞。目前研究最多的是骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stromal cell，BMSC）和人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stromal cell，hAMSC），是细胞移植的新型种子细胞。

（二）MSC的生物学特性

1.低免疫原性：目前MSC还没有找到理想的高度特异性表面抗原，它具有间质细胞、上皮细胞核内皮细胞表面抗原的特征，具有非单一性。它表达CD13、CD29、CD44、CD49d、CD54、CD59、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166等表面标志和Oct-4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4等胚胎干细胞标志。其中CD29和CD44被认为是MSC的重要表面标志物，不表达造血细胞的标志物，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达MHCⅡ类抗原及MHC抗原相关的共刺激分子C80、CD86及MHCⅡ类分子HLA-DR抗原等，具有低免疫原性[6-7]。Lazarus等[[8]]将体外不同浓度的异基因骨髓来源的MSC通过静脉输入志愿者体内，结果输入量达到5×107时，都未发生明显的免疫排斥反应。另有研究证明，hAMSC可抑制淋巴细胞增殖反应，同种异体和异种之间移植不会引起排斥反应[9-10]。

2.免疫调节作用：大量的研究实验证明MSC具有重要的免疫耐受和免疫抑制特性，可抑制免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞等）增殖、活化、因子的分泌以及诱导T细胞的凋亡。增加具有免疫抑制功能的调节性T淋巴细胞亚群[11]，Aggarwal等[12]将MSC和T细胞混合培养，然后在向其中加入Th1（一种抑制免疫因子）和Th2，研究发现MSC趋向于下调Th1的分化而上调Th2细胞的分化。MSC可抑制B细胞向抗体分泌细胞分化，抑制B细胞转化为成熟的浆细胞，从而减少抗体的产生[13-14]。MSC还能降低NK细胞的细胞毒性作用，减弱DC细胞的抗原提呈作用[15]。此外，MSC还能够产生多种生长因子、细胞因子、趋化因子以及可能在细胞免疫调节或迁移过程中起关键作用的蛋白酶[16]，可通过这些调节因子使体内炎性反应向抗炎反应转化，减轻炎症反应和组织损伤。

3.多向分化潜能：MSC具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能，不但可以向中胚层细胞分化，甚至可以跨越胚层，向外胚层及内胚层来源的组织细胞分化，可以分化成骨、软骨、肌肉组织、内皮细胞、心肌细胞、肝细胞、角膜上皮细胞、肺和气管上皮细胞、肾小管上皮细胞、神经细胞，从而为组织修复提供细胞来源[17-18]。

二、MSC体内移植对ALI的作用

1.MSC的归巢和定植：所谓MSC归巢，是指自体的或外源性MSC在多种因素的作用下定向趋向性迁移至靶向组织并定植的过程[19]。目前MSC的移植方式大致分为4种：经静脉、经动脉、局部移植和体腔内移植。静脉移植的优点损伤小，注射方便，并且细胞在运行途径中，由于肺的“首关效应”，大部分出现在肺里。Lee等[20]研究发现经静脉移植后15 min，80﹪的细胞可以在肺内发现。而到4 d时，迅速下降到只有0.01﹪。同时，他们还发现干细胞在肺内形成微栓子释放抗炎因子，进而加强抗炎作用。Mei等[21]对MSC在肺脏的归巢定植进行定量分析，研究发现向小鼠体内移植MSC，其中47﹪的MSC定植在LPS（脂多糖）诱发急性肺损伤的小鼠肺脏中，而健康小鼠肺脏中38﹪，并且无论有无肺损伤，MSC移植入小鼠体内3 d内，大部分MSC从肺脏中消失。Ortiz等[22]发现博来霉素致肺损伤模型组的肺组织比正常对照组所含MSC数量增加23倍，表明MSC有显著向损伤肺组织聚集现象。MSC来源可分为异种、同种异基因、自体及异体同基因（同卵双生），异种包括人MSC输注到NOD/SCID小鼠体内，同种异基因MSC移植在临床中使用最多，来自欧美14个中心的18 组MSC移植临床试验，其中11组为异基因移植，仅7组为自体移植[23]。临床多使用异体MSC的原因是异基因MSC来源广、不受限制，一个供者扩增后可输给多个受者。关于自体和异体MSC输入体内归巢的研究多来自动物实验，有限的研究资料[24]表明自体和异体的MSC在归巢特性上无差异；这可能是因为MSC表面不表达激活T细胞的共刺激分子[25]，免疫源性低，故自体和异体无区别。Anjos-Afonso等[26]发现一个有趣的现象，人干细胞通常不引起肺部的异常症状，而鼠类干细胞则可能在肺部聚集，并造成肺部损害。MSC定植于损伤的靶组织的过程类似于白细胞募集至炎症部位过程，其细胞因子的作用也有类似之处，也有其他研究支持这一观点[27-28]。在损伤部位的炎症反应促进干细胞归巢，一方面炎症时血流发生变化，比如血管变窄、血流速度变化，从而增加被动捕获的几率，另一方面，炎症反应所释放的因子促使主动捕获。

2.MSC的分化和修复作用：在ALI/ARDS过程中，细胞会发生坏死和凋亡，细胞之间的连接收到破坏，组织局部留下缺失和龛影，导致肺泡毛细血管膜屏障结构受到破坏，通透性增加[29]。多项研究表明移植入体内的外源性MSC能够在肺损伤区域分化为肺主要功能细胞，如肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞等，并发挥其相应的作用来修复损伤组织。Neuringer等[30]研究认为，BMSC可以修复肺泡上皮细胞，增加肺表面活性物质分泌，并可治疗新生儿或成人ARDS，Rojas等[31]发现MSC对博来霉素所致的急性肺损伤有保护作用，归巢的MSC分化为肺上皮细胞核肺血管内皮细胞从而保护受损的肺组织。黄坤等[32]在博来霉素诱导的肺损伤大鼠中，注入外源性MSC，发现MSC可归巢到损伤的肺组织内并转化为ATII，而且早期移入归巢率更高。以上的研究表明MSC植入后可在肺内分化为有功能的肺泡上皮细胞，替代损伤的肺泡上皮细胞，减轻肺损伤。

3.MSC的免疫调节作用：ALI/ARDS的发病机制错综复杂，其实质是炎症反应的综合征，包含大量的炎症反应和免疫调节反应，因此减少炎症反应被认为是改善其预后的一个重要方向[33]。针对ALI / ARDS 时失控性释放的炎性反应以及多种免疫细胞和炎性介质参与了ALI / ARDS发病，ARDS的免疫调节疗法已成为近年来的研究热点之一。目前研究较多的有：（1）内毒素拮抗剂；（2）细胞因子抗体及拮抗剂；（3）效应细胞抑制剂[34]。多项研究表明在肺损伤模型中MSC能够在ALI时下调促炎细胞因子，如：IL-1、IL-6、INF-γ、TNF-α、MIP-2，同时上调抗炎细胞因子，如：IL-10、IL-13，减轻肺水肿，从而对ALI/ARDS起到一定的治疗作用[21,35]。Gupta等[35]发现移植MSC能够增加肺损伤大鼠的生存率，并降低大鼠肺泡灌洗液（BALF）炎性因子MIP-2和TNF-α浓度，降低肺湿/干重比值、髓过氧化酶（MPO）活性，升高BALF及血浆中抗炎因子IL-10的水平，改善大鼠肺损伤。MSC除了可以调节外周炎症细胞因子白介素，还可以自身分泌白介素1受体拮抗剂（IL-1RA）。Ortiz等[36]在博来霉素诱导的小鼠肺损伤模型中发现，通过人MSC产生的IL-1RA减轻了小鼠肺损伤，明显减少肺胶原蛋白的堆积，减少肺纤维化。

4.MSC对肺泡液体清除作用：ALI可以引起肺泡上皮屏障的破坏，出现肺水肿。肺泡清除率（alveolar liquid clearace，ALO）降低被证实是导致肺换气功能障碍发生的重要原因，与ALI/ARDS病死率之间关系密切。Lee等[37]的实验发现内毒素介导的ALI发生1 h后将MSC注入肺支气管中，MSC通过旁分泌角质细胞生长因子的含量增高，上调Na-K ATP泵的活性，增强肺泡液体的转运，ALO恢复到正常水平，减轻肺水肿，从而降低肺损伤。

5.MSC对细胞凋亡的抑制作用：肺泡上皮细胞丧失和凋亡是ALI发生的另一重要病理机制。许多学者研究发现骨髓MSC通过旁分泌角质细胞生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等生物活性物质延缓肺实质细胞凋亡，促进肺实质细胞增殖，说明MSC对细胞凋亡具有潜在的调控作用。刘红梅等[38]发现骨髓MSC移植后肺气肿肺泡壁细胞的凋亡受到抑制，同时肺组织内Bcl-2蛋白表达明显增加，Bax蛋白表达减少，从而抑制细胞凋亡。MSC可能通过调整细胞凋亡基因的表达，分泌抗凋亡和促进增殖分化的细胞因子，加强细胞修复和促进增殖分化，这是MSC治疗ALI的另一个新的研究方向。

6.hAMSC的特点：相对于研究最为广泛的骨髓MSC而言，不仅具有和骨髓MSC相似的生物学活性，而且相对于骨髓MSC具有下面的优势：（1）剖宫产后的人羊膜是废弃物，不涉及伦理道德问题；（2）人羊膜取材方便；（3）保障充足的细胞来源；（4）人羊膜具有低免疫原性。人骨髓MSC不适宜冻存，无论是后续的实验还是在未来的临床应用，都需要采集新鲜的骨髓进行分离、培养及扩增，在今后的应用上有局限性。hAMSC可以冻存，而且数目充足，对再生医学领域中具有更大的意义，它的推广应用无疑可以解决很多疾病干细胞来源紧缺和免疫排斥等问题，因此，在ALI的治疗中，hAMSC可能是一种前景良好的新来源移植细胞，其体内治疗机理有待进一步深入探索。

三、小结

综上所述，MSC已经为ALI治疗提供了一个新的思路和方法，随着MSC和组织工程的不断深入研究，有理由相信上诉难题可以逐个解决，人类可以将MSC应用于临床，成为治疗ALI的有效手段。

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Advances in treatment of acute lung injury with mesenchymal stem cells

Qiang Yong,Liang Guiyou.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China

Liang Guiyou,Email:guiyou515@163.com

Acute lung injury (ALI) is a common critical disease,and its traditional treatments generally rely on the early removal of causes,infection control,mechanical ventilation and organ-supporting therapies.As a kind of adult stem cells,mesenchymal stem cells (MSC) can home to the site with lung injury and participate in tissue repair by differentiation into alveolar or bronchial epithelial cells.Meanwhile,MSC can regulate local and systemic inflammatory responses in ALI,which may be a promising treatment to ALI.This review focuses on the research progress of MSC transplantation in the treatment of ALI.

Mesenchymal stem cell；Acute lung injury；Revieul

2013-12-18）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.03.011

2013遵义市科技攻关项目 遵市科合社字[2013]38号

563003 遵义，遵义医学院附属医院胸心外科

梁贵友，Email:guiyou515@163.com

强勇,梁贵友.间充质干细胞移植治疗急性肺损伤的研究进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(3):211-216.