嗅觉的锰增强磁共振成像研究

王亚玲 孙宝宾

·综 述·

嗅觉的锰增强磁共振成像研究

王亚玲 孙宝宾

嗅觉系统是一种基本感觉系统，对人的日常生活和动物的生存都有重要的作用。目前，人们对嗅觉生理知识的了解还比较有限，对嗅觉系统神经通路的认识也不够深入。锰增强磁共振成像 (MEMRI)技术用于嗅觉系统的研究具有独特的优势，近年来，人们应用MEMRI技术对嗅觉中枢定位、神经通路追踪、嗅觉信息编码等方面的研究取得了一定的进展。本文就MEMRI技术在嗅觉系统相关方面的研究进展做一综述。

在哺乳动物的繁殖和学习中，嗅觉起着重要的作用。理解气味在中枢神经系统的处理和编码过程很关键，因为理解后可以确定一些行为的神经基础。要充分理解这些高级脑区的气味编码，揭示嗅球和嗅觉皮质的气味代表区域的方法就需要加以改进。一些方法[1-3]已经被用于嗅觉方面的研究：如2 -脱氧葡萄糖荧光显影、c-Fos蛋白的免疫检测、双光子钙成像(2-photon calcium imaging)和正电子发射断层扫描，但这些方法因存在检测区域局限、空间分辨率低等不足，在很大程度上限制了人们对嗅觉中枢的研究。功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging, fMRI)似乎比较合适，但fMRI是一种间接的表现，不能直接反映神经细胞本身的改变。有一些研究[4-5]证明，放射性Mn2+可以被神经元摄取并运输。以锰(Mn2+)为造影剂的磁共振成像技术(manganese enhanced MRI，MEMRI)是可以直接反映神经元功能和联系的一种新方法，具有较高的空间分辨率，可以在活体、动态地研究神经传导通路和大脑功能成像，对嗅觉系统的研究具有独特的优势。本文在简单介绍嗅觉知识、Mn2+生物特性的基础上，着重对近年来MEMRI在嗅觉系统方面的应用进行综述。

1 嗅觉神经系统

1.1 嗅觉系统结构及机制 哺乳动物的嗅觉系统主要包括主嗅觉系统(main olfactory system)和副嗅觉系统(accessory olfactory system)[6]。主嗅觉系统由鼻腔中的嗅上皮、主嗅球及其投射皮质组成；副嗅觉系统由外周犁鼻器中的嗅觉感受器、副嗅球及其投射皮质组成。虽然这2个通路具有一定的交叉，但大多数学者认为，主嗅觉系统针对一般气味的识别、分辨和检测，而副嗅觉系统与信息素处理功能有关。其他如三叉神经末梢、终神经末梢、马赛若鼻中隔器(septal organ of Masera)也与嗅觉有关，但它们作为化学感受器具有哪些功能、如何影响动物行为和生理的机制目前尚不清楚[7]。

对于嗅觉产生的机制，目前认为是气味分子与鼻腔嗅上皮的敏感嗅细胞结合，通过主要的嗅神经将气味信息传递到嗅球，气味信息在嗅球中经过空间和时间编码后再传递到嗅觉皮质，最后经过解码形成不同的化学感觉。

1.2 嗅觉系统功能 嗅觉系统是感觉神经系统的一个重要组成部分，对动物和人类都有重要的作用。动物通过嗅觉来觅食、识别、报警等。例如，猫通过嗅觉来寻找到鱼虾、老鼠等食物；警犬依靠灵敏的嗅觉在缉毒、军事等方面发挥作用。人类利用嗅觉来辨别气味、增进食欲、识别危险环境等。例如发生火灾时，人们通过嗅觉闻到烟味，就可以尽早采取抢救和逃生措施。另外，嗅觉还在人类生理和心理反应中发挥重要的作用，如影响人的情绪、调节生命周期等。对于一些从事特殊职业的人，灵敏的嗅觉更是必不可少，例如香水调剂师，他们对气味的分辨能力很强，嗅觉比正常人灵敏很多。

2 Mn2+的生物特性

2.1 Ca2+类似物 Mn2+是一种Ca2+的类似物，Mn2+的离子半径与Ca2+的离子半径类似，生理作用也与Ca2+类似。在神经细胞去极化时Mn2+可以通过电压门控的Ca2+通道进入细胞，Mn2+进入神经细胞后，被微管运输系统运输到轴突突触，此处，Mn2+随神经递质释放，然后被突触后膜摄取[8]。由此可知Mn2+可以作为Ca2+的示踪剂，通过跨突触方式来映射整个神经信号传导通路。另外，有实验[9]表明，Ca2+通道的阻断剂可阻止Mn2+在中枢神经系统中的正常运输，进一步证明了Mn2+是Ca2+类似物的特性。

2.2 Mn2+的顺磁性 顺磁性离子能使水的快速弛豫时间缩短，而Mn2+具有顺磁性，这就导致Mn2+无论在什么组织中积累，都将会在T1加权MR图像上有阳性的对比增强。也就是说，Mn2+积累的区域，在TlWI上表现为白色的高信号[9]。Mn2+作为强顺磁性Ca2+竞争剂，可以直接反映活体神经元活动引起的Ca2+活动，并能通过轴突、突触运输，在MR TlWI图像上反映出来。因此，Mn2+可以用来追踪嗅觉神经通路。

2.3 Mn2+生物利用的局限性 有研究[10]报道，外源性Mn2+被神经细胞吸收后，可以引起一定的生物毒性，并且Mn2+浓度越高，神经毒性越明显。所以进行嗅觉研究时，注入Mn2+的剂量必须尽量减少。有研究[11]报道，大鼠鼻腔给锰时，0.3 μmol剂量的锰是一种最佳选择，既不会达到锰中毒，又能得到足够的成像对比度。此外，Mn2+在神经元中代谢非常慢，滞留时间也较长[12]，从而在大脑功能活动中的时间分辨率不高。同时Mn2+在神经系统中的传递和积累是比较慢的，并且只有积累到一定的量才可被MRI检测到，所以MEMRI需要一定的时间才能完成。

3 MEMRI在嗅觉系统的应用

3.1 MEMRI在嗅觉系统应用的优势 MEMRI用于嗅觉系统的研究具有独特的优势，主要表现为以下几点：①MEMRI技术利用的是T1加权成像方法，对磁场的不均匀度不敏感；②MEMRI成像的空间分辨率受成像系统的硬件条件及成像序列的限制比较小，可以得到高空间分辨率的图像；③成像质量受生理噪声的影响较小；④Mn2+的顺磁性，能缩短周围组织T1弛豫时间，在TlWI上对比信号明显；⑤MEMRI并不依赖于血流动力学的变化，无BOLD脑功能成像中血管效应的影响。因此具有空间分辨率高、信噪比高、对比度强、易于操作等优点。利用MEMRI技术可以在体、无创、动态地研究嗅觉系统，不仅可以帮助我们更深入了解生物的嗅觉机制，而且对于理解其他感觉神经系统和脑的信息处理机制等方面也有很重要的价值。

3.2 MEMRI在嗅觉系统中的研究进展

3.2.1 嗅觉系统通路的研究 MEMRI具有较高的空间分辨率，可以精细地观察到嗅觉系统通路的相关结构。Pautler等[9]是较早应用Mn2+造影来研究小鼠嗅觉系统通路的，其研究发现小鼠鼻腔中滴入的Mn2+可以沿嗅觉神经传导通路运输。Mn2+的运输径路为：嗅上皮、嗅神经、嗅球、嗅束及嗅皮质，并且Mn2+有选择性地沉积在嗅觉功能活跃的区域，如嗅球的嗅小球层。方可等[13]应用MEMRI技术对大鼠嗅觉神经传导的研究发现，高分辨的MEMRI可以清晰显示出嗅球的层状结构，包括嗅神经层、嗅小球层、外网丛层、颗粒细胞层和皮下区域。另外，Mn2+不仅在嗅上皮和嗅球中沉积，还能随嗅觉神经传导通路到达嗅觉皮质，这与Pautler等的研究结果一致。Lehallier等[11]研究发现，不同浓度Mn2+溶液体外试管MRI扫描，随浓度增强，信号增强；MEMRI示踪活体大鼠嗅觉通路神经纤维束的传导，按照嗅神经、嗅球、嗅觉中枢的顺序，随时间逐渐强化。

Chuang等[14]在研究啮齿类动物嗅觉系统时发现，高分辨的MEMRI可以显示出嗅球的单个嗅小球结构，并提出优化表面线圈的选择及关注心率和呼吸门控对减少潜在的伪影和改善嗅小球的检测有一定的作用。Gutman等[8]用MEMRI和弥散张量成像(diffusion tensor imaging ，DTI)2种技术来映射小鼠的嗅觉系统，结果发现，DTI 和MEMRI 2种技术可以清楚地显示嗅球、杏仁核、梨状皮质和尾状壳核，2种方法显示的结构有很大程度的一致性，但两者之间最显著的差异是在嗅觉通路末端的一些连接，如到内嗅皮质的连接，DTI显示了连接而MEMRI没有显示。这可能与Mn2+滴入的剂量不足等有关。

这些研究说明Mn2+能很好地用于追踪嗅觉系统通路，Mn2+的跨突触运输具有时间依赖性以及剂量依赖性，并且MEMRI技术需依靠完整的嗅觉系统结构及完善的功能性突触传递。

3.2.2 嗅觉刺激诱导的MEMRI研究 近年来，有不少学者通过不同的嗅觉刺激进行嗅觉系统的MEMRI研究。Lehallier等[15]在大鼠脑对不同生物学气味处理的MEMRI研究中发现，Mn2+可增强大鼠嗅觉相关皮质，并且Mn2+增强对不同气味刺激有不同的敏感度。含捕食者信息的气味可以引起更强的刺激，同时可引起情绪相关脑区的激活。Chuang等[16]对小鼠嗅觉的研究发现，Mn2+可以显示从嗅上皮到嗅小球的嗅觉传导通路，其传导通路的显示与嗅小球Ca2+通道的状态、有无气味刺激相关；有味刺激的小鼠嗅觉皮质比无味对照有更明显的强化，不同的气味刺激嗅觉皮质的强化区域及程度有明显差异。还有学者[9]通过嗅觉刺激的MEMRI研究发现，一种特定的气味可以引起嗅觉特定区域的激活；富含信息素的气味可以引起副嗅觉系统特定部位的激活。这些区域的激活同先前用2 -脱氧葡萄糖和BOLD-fMRI在大鼠嗅觉系统研究的结果一致。这些嗅觉刺激的MEMRI研究表明，Mn2+在嗅觉通路的运输依赖于激活的神经元的存在，即有活动依赖性。应用MEMRI技术，可以较好地映射多种不同的气味，便于进一步分析大脑对不同生物学信息气味的处理。

3.2.3 嗅觉异常的MEMRI研究 Kivity等[17]对实验性神经精神狼疮小鼠的嗅觉MEMRI研究发现，与对照组小鼠相比，神经精神狼疮小鼠组嗅觉结构的Mn2+增强程度显著下降，嗅觉通路上的几个区域，如嗅球、嗅结节、梨状皮质的功能Mn2+增强比例明显减低。Stepens等[18]研究发现，帕金森病模型组伴有嗅觉功能异常，Mn2+在其嗅觉传导通路的运输速率较正常组显著减慢。目前对嗅觉系统方面的MEMRI研究，主要集中在对正常嗅觉结构的解剖定位及嗅觉通路的追踪，对嗅觉异常方面的研究还比较少见。

根据以上相关研究，我们可以得出MEMRI在研究嗅觉系统中，不但可以观察嗅觉相关精细结构，而且可以追踪嗅觉系统通路，可以映射嗅觉相关大脑区的激活，对进一步了解有关嗅觉编码和连接方面有重要作用，为深入理解嗅觉处理的分子机制提供影像学基础。另外，对嗅觉异常脑区的检测也是一种客观的检查方法。

3.3 MEMRI在嗅觉系统应用的注意事项

3.3.1 Mn2+给药方式 Mn2+应用于嗅觉系统研究，主要分为全身给药和鼻腔给药2种方式，其中全身给药包括皮下注射、腹膜内给药及静脉注射3种。全身给药涉及开放血-脑屏障的问题，另外，全身给Mn2+，除了长期公认的外周作用外，已被证明还对运动功能相关的脑结构有影响[19]。但到目前为止，全身给药是否会对嗅觉感知产生影响还没有相关报道。

由于Mn2+易于被鼻腔嗅上皮的嗅细胞吸收，鼻腔给药时就无需破坏血-脑屏障。但Mn2+注入鼻腔后，会有漏到呼吸道和(或)消化道的可能，也会间接到达脑结构产生一些行为效应。另外，有研究[11]报道，鼻腔滴入的Mn2+过量可以引起嗅觉感知的改变。所以对于鼻腔给药，Mn2+剂量很重要，合适的剂量既可以检测到嗅觉通路上信号，又可以保持嗅觉感知。

3.3.2 麻醉的问题 对于嗅觉刺激的MEMRI研究，合适的麻醉深度既可以抑制全脑的基础活动，又不阻碍嗅觉刺激脑区的活化。一个稳定的麻醉水平易于检测嗅觉通路的激活，也可以减少呼吸运动伪影对MRI的干扰。另外，许多嗅觉研究中使用异氟烷气麻药，此麻醉剂有很强的气味，可能会激活嗅觉神经元并改变Mn2+的吸收和嗅球的增强模式。因此，保持实验过程中麻醉水平的相似性，比较不同的实验组，可以减少麻醉剂这种背景气味的干扰[16]。

3.3.3 MEMRI的处理 目前组间图像分析的后处理技术已经比较成熟，通过图像标准化，与安静状态下的动物脑区图进行相减，就可以得到比较可靠脑区的激活图像[20]。图像的标准化是由多个动物激活脑图的平均激活图得来的，因此，可以比较真实地反映动物脑区的激活状态。另外，由不同的实验对象获得空间和强度标准化的MEMRI图像也是很关键的，目前还没有一个广为认可的图像空间和强度标准化的方法，但最近有相关研究提出了一种新的方法[21]，表现为在一个迭代的过程中空间和强度的归一化，没有参考图像的随意选择，这个迭代过程有益于空间和强度的标准化。

总之，MEMRI是一项很有前景的技术，有利于小动物嗅觉功能的研究，其显示脑区激活的可靠性得到认同，是研究嗅觉系统正常和病理状态的理想工具。需要改善的地方是寻找一种更好的Mn2+注入方法，以确保更均匀、更快速的大脑生物利用度，这将能够缩短Mn2+注入和成像之间的延迟，从而降低Mn2+的神经毒性。由于Mn2+的生物毒性作用，MEMRI实验目前主要在小动物尤其是啮齿类动物如小鼠、大鼠上进行，还没有应用于人类嗅觉研究的报道。但有关Mn2+螯合物用于临床上肝脏和其他脏器的对比成像已有报道[22]。目前，MEMRI的发展趋势是在克服其局限性和不足之处的同时联合应用其他检查技术来弥补自身缺陷。随着MEMRI技术的不断发展及新型Mn2+增强对比剂的研发，其将会在临床上有广泛的应用前景，尤其是在嗅觉相关疾病的诊断、疗效监测等方面发挥重要作用。

[ 1 ] Johnson BA, Ong J, Leon M. Glomerular activity patterns evoked by natural odor objects in the rat olfactory bulb are related to patterns evoked by major odorant components[J]. Comp Neurol,2010, 518(9): 1542-1555.

[ 2 ] Schwarz J, Burguet J, Rampin O, et al.Three-dimensional macronutrient-associated Fos expression patterns in the mouse brainstem[J]. PLoS ONE, 2010,5(2): 8974.

[ 3 ] Savic I, Berglund H .Androstenol-a steroid derived odor activates the hypothalamus in women[J]. PLoS ONE ,2010,5(2): 8651.

[ 4 ] Chan KC, Li J, Kau P, et al.In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging[J]. Neuro Image ,2011,54(1): 389-395.

[ 5 ] Weng JC, Chen JH, Yang PF, et al. Functional mapping of rat barrel activation following whisker stimulation using activity-induced manganese-dependent contrast[J]. Neuroimage, 2007,36(4):1179-1188.

[ 6 ] Lledo PM, Gheusi G, Vincent JD. Information Processing in the Mammalian Olfactory System [J].Physiol Rev, 2005, 85(1): 281-317.

[ 7 ] Kimchi T, Xu J, Dulac C. A functional circuit underlying male sexual behavior in the female mouse brain[J]. Nature, 2007,448(7157): 1009-1014.

[ 8 ] Gutman DA, Magnuson M, Majeed W, et al. Mapping of the mouse olfactory system with manganese-enhanced magnetic resonance imaging and diffusion tensor imaging[J]. Brain Struct Funct ,2013, 218(2): 527-537.

[ 9 ] Pautler RG, Koretsky AP. Tracing odor-induced activation in the olfactory bulbs of mice using manganese-enhanced magnetic resonance imaging[J]. Neuroimage, 2002, 16(2): 441-448.

[10] Jiang Y, Zheng W, Long L, et al. Brain magnetic resonance imaging and manganese concentrations in red blood cells of smelting workers: search for biomarkers of manganese exposure[J]. Neurotoxicology,2007, 28(1):126-135.

[11] Lehallier B, Coureaud G, Maurin Y, et al. Effects of manganese injected into rat nostrils : implications for in vivo functional study of olfaction using MEMRI[J]. Magn Reson Imaging, 2012,30(1): 62-69.

[12] Chuang KH , Koretsky AP, Sotak CH .Temporal changes in the T1 and T2 relaxation rates (DeltaR1 and DeltaR2 ) in the rat brain are consistent with the tissue-clearance rates of elemental manganese[J]. Magn Reson 2009, 61(6): 1528-1532.

[13] 方可，李英霞，刘华，等. 锰离子增强磁共振成像在大鼠嗅球神经传导及早期确定脑缺血中心研究中的应用[J].科学通报，2004，49(16)：1627-1632.

[14] Chuang KH, Belluscio L, Koretsky AP. In vivo detection of individual glomemli in the rodent olfactory bulb using manganese enhanced MRI[J]. Neuroimage, 2010, 49(2): 1350-1356.

[15] Lehallier B, Rampin O, Saint-Albin A, et a1. Brain processing of biologically relevant odors in the awake rat, as revealed by manganese-enhanced MRI[J]. PLoS ONE, 2012, 7(10): 48491.

[16] Chuang KH, Lee JH, Silva AC,et a1. Manganese enhanced MRI reveals functional circuitry in response to odorant stimuli[J]. Neuroimage, 2009, 44(2):363-372.

[17] Kivity S, Tsarfaty G, Agmon-Levin N. Abnormal olfactory function demonstrated by manganese-enhanced MRI in mice with experimental neuropsychiatric lupus[J]. Ann NY Acad Sci, 2010,1193(1): 70-77.

[18] Stepens A, Logina I, Liguts V. et a1. A Parkinsonian syndrome in methcathinone users and the role of manganese[J] . N Engl J Med, 2008, 358(10): 1009-1017.

[19] Baek SY, Cho JH, Kim ES, et al. cDNA array analysis of gene expression profiles in brain of mice exposed to manganese[J]. Ind Health, 2004,42(3):315-320.

[20] Chen W, Tenney J, Kulkarni P, et a1.Imaging unconditioned fear response with manganese-enhanced MRI (MEMRI) [J]. Neuroimage, 2007, 37(1):221-229.

[21] Lehallier B, Andrey P, Maurinb Y,et al. Iterative algorithm for spatial and intensity normalization of MEMRI images. Application to tract-tracing of rat olfactory pathways[J] . Magn Reson Imaging, 2011, 29(9)： 1304-1316.

[22] Bertin A, Steibel J, Michou-Gallani AI, et a1. Development of a dendritic manganese-enhanced magnetic resonance imaging(MEMRI)contrast agent: synthesis, toxicity(in vitro)and relaxivity(in vitro,in vivo)studies[J]. Bioconjug Chem，2009, 20(4):760-767.

(本文编辑 杨美琴)

东南大学附属中大医院耳鼻咽喉头颈外科 南京 210009

孙宝宾(Email: sbbys@sina.com)

现为东南大学医学院研究生

2013-07-14)