microRNA在过敏性哮喘中的作用

蒋聪利，刘志刚，夏立新#

(1深圳大学过敏反应与免疫学研究所，深圳 518060；2深圳大学生命科学学院，深圳 518060)

哮喘是肺部慢性炎性疾病，可引起患者气道高反应、黏液分泌增多和气流阻塞等[1]。近10余年来，全世界约有1亿哮喘患者，哮喘已成为威胁公众健康的主要慢性炎性疾病。当受到多种环境过敏原、运动、呼吸道病毒感染或某些刺激物影响时，哮喘可能从最初良性的间歇性发作发展为严重哮喘[2]。过敏性哮喘是哮喘的一种最常见类型，主要是由吸入性过敏原引起的一系列哮喘症状，持久的气道炎性反应是过敏性哮喘的主要病理学改变。这些改变包括支气管黏膜肿胀，分泌物增多，气道内炎性细胞浸润，气道平滑肌痉挛等。目前，针对哮喘的治疗方法主要是β-肾上腺素受体激动剂、白三烯调节剂、吸入糖皮质激素，避免过敏原和刺激物，或进行免疫治疗，但上述方法周期较长且疗效短暂，至今尚不能抑制哮喘发生或完全治愈[3]。

哮喘发生的根本原因尚未阐明，多数治疗手段仍为对症治疗。研究过敏性哮喘发病机制需涉及组织学、分子和基因变化及蛋白表达，而microRNA(miRNA)是基因表达的重要调控因子，自10年前在哺乳动物细胞中被发现后，其在许多人类疾病中的作用逐渐凸显[4]；miRNAs在哮喘病因学的研究中也逐渐受到重视，其可能为过敏性哮喘的病理研究和治疗方法带来根本性改变。

miRNA的生物起源和作用机制

miRNA是真核生物体内具有调控功能的一类非编码RNA，主要位于基因组的内含子、外显子及基因间隔区。类似于mRNA，miRNA在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ转录，最初产物pri-miRNA具有5’端帽子结构和3’端多聚腺苷酸尾巴的独特结构。pri-miRNA在核酸酶Drosha和辅助蛋白的共同作用下形成约70 nt的茎环结构，其突出特征是茎环结构处具有未完全配对的碱基，且在3’末端有2个突出的核苷酸。pri-miRNA的茎环结构被细胞核运输蛋白Exportin5识别，与RNA-GTP结合后将pri-miRNA运送至细胞质。随后，在RNAseIII、Dicer、双链RNA结合蛋白TRBP的作用下，pri-miRNA被切割成约为22个碱基对的双链miRNA。成熟miRNA中的1条链合并至沉默复合体中，成熟miRNA即可通过碱基互补配对实现对基因表达的调控[5-7]。miRNA可能有数百个靶基因，1个靶基因也可能由大量的miRNA调控，从而形成了复杂的基因调控网络。miRNA还可通过表观遗传机制(如DNA甲基化、组蛋白乙酰化)或调控转录因子影响整体基因表达[8]。因此，miRNAs可能是调控过敏性炎性反应的一类最具研究潜力的重要分子。

miRNA在过敏性哮喘中的功能

辅助T淋巴细胞极化和辅助T2淋巴细胞型细胞因子调节

T淋巴细胞是过敏性疾病患者参与机体免疫应答的重要细胞成分。Muljo等[9]构建了缺失RNAs和miRNAs加工酶Dicer的小鼠模型，结果发现Dicer酶缺失后T淋巴细胞发育受损，数量减少且趋向凋亡；辅助T(helper T，Th)细胞增殖减弱，且偏向于表达Th1型细胞因子干扰素-γ。目前，多数研究主要集中在单个miRNA对调节Th细胞分化和激活的影响。在Th细胞的发育过程中，miRNA-181a能够增强T淋巴细胞对外界抗原的敏感性，若抑制未成熟T淋巴细胞中miRNA-181a的表达，可降低抗原敏感性、破坏Th细胞的选择性，在miRNA-181a/b缺失的小鼠模型中，一系列T淋巴细胞受体的信号强度发生了改变[10-11]。因为过敏性哮喘是Th2细胞相关炎性疾病，所以Th细胞极化发育在过敏性哮喘发病机制的研究中至关重要。有关过敏性哮喘模型的研究发现，炎性肺组织中肥大细胞和树突状细胞内的miRNA-21表达过量。白细胞介素(interleukin，IL)-12 p35 3’UTR是miRNA-21靶序列中的保守序列，也是miRNA-21的作用位点，而IL-12是适应性免疫应答中Th1细胞极化的关键分子。另外，miRNA-21缺失的CD4+T淋巴细胞中干扰素-γ水平上升而IL- 4水平下降，猜测miRNA-21通过影响IL-12 p35的表达来调节Th1和Th2之间的平衡[12]。miRNA-126在肺组织发育过程中具有重要作用。在尘螨过敏性哮喘模型中，miRNA-126在气道管壁细胞中依赖Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)4和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)表现出上调趋势，通过miRNA拮抗剂抑制miRNA-126高表达量后可减轻哮喘症状，Th2细胞因子(如IL-5、IL-13)和黏液分泌量均呈减弱趋势[12]。Let-7是首个被发现的人类miRNA家族成员，包含Let-7a～Let-7k。IL-13mRNA是Let-7的靶序列，在过敏性哮喘小鼠模型中，当使用抗let-7的miRNA拮抗剂作用于let-7a、let-7b、let-7c和let-7d后可减轻支气管肺泡灌洗液中炎性细胞浸润并下调IL- 4、IL-5、IL-13的水平[13]。Kumar等[14]也发现，给予过敏性气道炎性反应小鼠下调let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7f、let-7g和let-7i，可抑制IL-13分泌，从而减轻过敏性哮喘各种症状。因此，Let-7 miRNA在Th2炎性反应中是IL-13的一种主要调节途径。另外，还有一些其他的miRNA也在过敏性哮喘中发挥作用，如miRNA-155可调控调节性T(regulatory T，Treg)细胞和Th17细胞分化，miRNA-146可选择性作用于Treg细胞，从而抑制Th1反应等。

miRNA与肥大细胞

肥大细胞是IgE相关过敏性疾病的关键效应细胞，具有免疫调节功能。在接触过敏原时，肥大细胞可释放炎性调节因子，其在发育过程中也受到miRNA调控。miRNA-221和miRNA-222在肥大细胞激活后明显上调，可通过调节细胞周期抑制剂p27(kip1)的表达抑制细胞增殖。miRNA-221和miRNA-222同时过表达会引起大量肥大细胞处于G0/G1期，少量处于G2/M期[15]。肥大细胞中miRNA-221具有肥大细胞特异性，其上调易引起脱颗粒增多、迁移减少、黏附性增加，且与细胞骨架调控和细胞因子分泌有一定联系[16]。肥大细胞激活后，上调的miRNA-146a会增加肥大细胞凋亡；miRNA-142-3p过表达可增强FcεRI受体介导的肥大细胞脱颗粒，miRNA-142-3p有可能作为过敏性反应治疗的药物作用靶点[17]。在肥大细胞分化期间，miRNA-126通过作用于肥大细胞增殖副调控因子Spred1的基因而抑制肥大细胞增殖[18]。尽管目前发现许多miRNA与肥大细胞的增殖、分化和激活过程相关，但关于miRNA在肥大细胞中的功能还需进一步研究。

平滑肌细胞和上皮细胞内的miRNA

miRNA也能通过在支气管平滑肌细胞和上皮细胞中的活动影响过敏性哮喘。平滑肌细胞是气道高反应中主要的效应细胞，在过敏性哮喘发病机理的研究中至关重要。miRNA-133a是一种肌肉特异性miRNA，有研究报道，当受到IL-13刺激后，miRNA-133a在人气道平滑肌细胞内水平下调，而RhoA激酶表达增多，RhoA激酶为机体内与平滑肌收缩相关的酶。miRNA-133a能显著减弱IL-13所致GTP激酶RhoA的基因表达，合成miRNA-133a以抑制RhoA激酶基因表达，从而减轻气道高反应性[19]。当过敏性哮喘患者的气道平滑肌细胞受到肿瘤坏死因子-α刺激后，细胞内miRNA-140-3p表达下调，而miRNA-140-3p可通过与CD38 3′-UTR结合或间接涉及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核转录因子Kappa B活性来调节CD38的表达，而CD38是与钙离子动员和细胞收缩相关的平滑肌细胞中的一种膜蛋白[20]。

最近研究表明，在过敏性哮喘患者和正常人体内有66种miRNA在上皮细胞中的表达量不同，通过整个分子网络分析表明，这些miRNA的目标基因序列编码疾病和炎性反应相关的蛋白，如IL-8、IL-6、环氧化酶2、肿瘤坏死因子-α和水通道蛋白- 4[21]。Let-7家族miRNA与纤维化相关，当肺上皮细胞受到尘螨抗原刺激后，会引起let-7g miRNA 骤减[22]。这些研究表明，增强促炎性通路的活性、改变紧密连接蛋白的表达或其他所观察到的哮喘患者上皮细胞变化，这些病理特征或许部分可归于潜在miRNA异常表达。

miRNA在过敏性哮喘诊断及治疗中的应用

胞外miRNA作为诊断过敏性哮喘生物指标

miRNA在机体不同组织、细胞、发育阶段甚至不同疾病状况中表达特性各异，这一点与基因表达情况类似。最近研究表明，在血浆、血清、尿液和唾液等无细胞体液中发现了miRNA的存在[23]。因miRNA比mRNA和蛋白质分子更稳定，所以有研究者提出是否可以将血清中的miRNA作为检测疾病的生物指标；胞外miRNA是否能够进入受体细胞并发挥作用；miRNA是否能够用来进行细胞间交流。自2008年首次报道了胞外miRNA且指出可通过血清中miRNA-141水平来诊断前列腺癌[24]后，大量后续研究证明，miRNA可以作为癌症、组织损伤、炎性反应，甚至特定精神疾病诊断、预后和预测的生物指标。研究表明，血清miRNA也可作为不同过敏性疾病的生物指标，在慢性阻塞性肺疾病患者的血清中发现，miRNA-20a、miRNA-28-3p、miRNA-34c-5p和miRNA-100显著下调而miRNA-7上调，中度哮喘患者和正常人支气管肺泡灌洗液中miRNA构成明显不同[21]。哮喘是由大量不同的潜在病理生理学变化构成的复杂慢性疾病，可依据不同的临床特征和生理变化将其分成不同类别，特异性胞外miRNA作为生物学指标以区别哮喘内在病理变化的依据是值得深入研究的方向。

miRNA在过敏性哮喘治疗中的作用

目前，关于过敏性疾病的治疗旨在减轻症状，尚不能抑制哮喘及其他过敏性疾病的发生。过敏性哮喘治疗方法主要包括两种，一是吸入性糖皮质激素，但这些抗炎药物对于中度和重度过敏性哮喘患者效果并不明显，该方法并不能特异性针对哮喘内在机制且易产生糖皮质激素抗性等不良反应；二是过敏原特异性免疫治疗，方法有效但周期较长，且目前过敏原疫苗成分复杂，难以标准化[25]。抑制Th2细胞因子治疗复杂多样化的哮喘并无足够。miRNA是机体产生的内源性小分子，许多组织利用其来调控基因网络的表达。作用于特异性miRNA，从而通过基因表达调控治疗过敏性哮喘，这或许为过敏性哮喘的治疗开辟一个新的研究方向。人工合成的短双链siRNA也可以发挥使基因沉默的作用，当人工siRNA导入受体细胞后，尽管靶基因序列的表达被抑制，但易造成无法预测的脱靶效应，从而引起治疗的毒副作用[26]。若将外源性miRNA导入细胞，同一免疫反应通路内的若干相关基因可能都会受到影响。由于miRNA的设计保持了进化过程中的天然性，即使在治疗过程中错误引入细胞可能也不会产生毒副作用。因此，miRNA可作为无毒副作用的方法来治疗过敏性炎性疾病[21]。因此，可以将作用于pri-miRNA、pre-miRNA和miRNA等加工过程的小分子抑制剂作为药物，通过调节miRNA表达来治疗过敏性哮喘。然而，尽管miRNA本身无毒，但其运输载体可能会引起不良反应，所以需要研究出更多低毒的miRNA表达调节特异性强的运送方法，这些都将为miRNA作为未来过敏性哮喘的治疗手段奠定基础。

关于miRNA用于疾病治疗的研究已逐渐增多。首个miRNA靶向药物——抗miRNA-122寡聚核苷酸已作为抗丙型肝炎病毒的药物进入临床实验[27]。有研究指出，选择性封闭miRNA-126可以抑制哮喘表型，使Th2反应、炎性反应、气道高反应、嗜酸粒细胞聚集和黏液分泌均减弱[28]。气道重塑是过敏性哮喘中的一大特征，miRNA-155与肺部炎性细胞浸润和气道重塑相关。越来越多的miRNA被发现与过敏性哮喘疾病发展有关，从而使其成为最有潜力的治疗手段，且基于miRNA的治疗药物已进入临床实验期[29]。现代研究技术的发展将会使得研究者更深入的了解miRNA在基因表达调控中的作用和其与哮喘发病机制间的相关性，从而利用miRNA使过敏性哮喘的治疗更加个性化。

总结和展望

近几年，我国由于污染严重出现较多雾霾天气，且气候变暖使花粉季节延长等，这些环境因素的改变都将使过敏性哮喘患病率和发病率增加。所以，研究过敏性哮喘发病机制、建立有效治疗方法显得十分必要和重要。miRNA在过敏性哮喘病理研究中的功能还需进一步深入，目前大部分研究集中在单个miRNA针对某个靶mRNA的作用，仅了解病变组织中某些miRNA的变化是不够的，例如在针对Th细胞的反应中，大部分miRNA是协调发挥作用的，而某个关键miRNA又可影响多个靶mRNA。因此，为了更加全面理解过敏性疾病和哮喘的发病机制，应针对这些发生变化的miRNA进行系统研究，建立分子网络。另外，miRNA出现在无细胞体液中，且较其他小分子稳定，使得其具有作为过敏性哮喘诊断和预后的生物指标的潜能，通过miRNA表达调控亦可达到治疗疾病的目的。随着生物信息学、基础免疫学、RNA生物学、基因组学、蛋白组学等不同领域发展，将会有助于了解受miRNA调节或调节miRNA的过敏性哮喘病理通路，从而使miRNA成为过敏性疾病治疗的新方向。

[1]So-Hee Lee， Eun-Bong Lee， Eun-Soon Shin，et al. The interaction between allelic variants of CD86 and CD40LG：A common risk factor of allergic asthma and rheumatoid arthritis[J].Allergy Asthma Immunol Res， 2014， 6：137-141.

[2]Maestrelli PL， Boschetto P， Fabbri LM，et al. Mechanisms of occupational asthma[J].J Allergy Clin Immunol， 2009， 123：531-542.

[3]Wang JW， Li K， Hellermann G，et al. Regulating the regulators：microRNA and Asthma[J].World Allergy Organ J， 2011， 4：94-103.

[4]Chavali S， Bruhn S， Tiemann K，et al. MicroRNAs act complementarily to regulate disease-related mRNA modules in human diseases[J].RNA， 2013，19：1552-1562.

[5]Plank M1， Maltby S， Mattes J，et al. Targeting translational control as a novel way to treat inflammatory disease：the emerging role of microRNAs[J].Clin Exp Allergy， 2013， 43：981-999.

[6]刘英，黄晓曦. miRNA在原发性肝癌中的研究进展[J].海南医学，2013，24：1786-1789.

[7]Rebane AL， Akdis CA. MicroRNAs in allergy and asthma[J].Curr Allergy Asthma Rep， 2014， 14：424.

[8]Watanabe KL， Takai D. Disruption of the expression and function of microRNAs in lung cancer as a result of epigenetic changes[J].Front Genet， 2013，4：275.

[9]Muljo SA， Ansel KM， Kanellopoulou C. Aberrant T cell differentiation in the absence of Dicer[J].J Exp Med， 2005，202：261-269.

[10] Li QJ， Chau J， Ebert PJ，et al. miR-181a is an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection[J].Cell， 2007，12 9：147-161.

[11] Zieętara N，yszkiewicz M， Witzlau K，et al. Critical role for miR-181a/b-1 in agonist selection of invariant natural killer T cells[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2013，110：7407-7412.

[12] Lu TX， Rothenberg ME. Diagnostic， functional， and therapeutic roles of microRNA in allergic diseases[J].J Allergy Clin Immunol， 2013， 132：3-13.

[13] Polike Pahad S， Knight JM， Naghavi AO，et al.Proinflammatory role for let-7 microRNAS in experimental asthma[J].J Biol Chem， 2010，285：30139-30149.

[14] Kumar M， Ahmad T， Sharma A，et al. Let-7 microRNA-mediated regulation of IL-13 and allergic airway inflammation[J].J Allergy Clin Immunol，2011，128：1077-1085.

[15] Mayoral RJ， Pipkin ME， Pachkov M，et al. MicroRNA-221-222 regulate the cell cycle in mast cells[J].J Immunol， 2009，182：433- 445.

[16] Mayoral RJ， Deho L， Rusca N，et al. MiR-221 influences effector functions and actin cytoskeleton in mast cells[J].PLoS One， 2011，6：e26133.

[17] Yamada Y， Kosaka K， Miyazawa T，et al. miR-142-3 Penhances FcεRI-mediated degranulation in mast cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，443：980-986.

[18] shizaki T， Tamiya T， Taniguchi K，et al. miR126 positively regulates mast cell proliferation and cytokine production through suppressing Spred1[J].Genes Cells， 2011，16：803-814.

[19] Chiba Y， Misawa M. MicroRNAs and their therapeutic potential for human diseases：MiR-133a and bronchial smooth muscle hyperresponsiveness in asthma[J].J Pharmacol Sci， 2010，114：264-268.

[20] Jude JA， Dileepan M， Subramanian S，et al. miR-140-3 pregulation of TNF-α-induced CD38 expression in human airway smooth muscle cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2012， 303：460- 468.

[21] Rebane A， Akdis CA. MicroRNAs：Essential players in the regulation of inflammation[J].J Allergy Clin Immunol， 2013，132：15-26.

[22] van der Velden JL， Hoffman SM， Alcorn JF，et al. Absence of c-Jun N-terminal kinase 1 protects against house dust mite-induced pulmonary remodeling but not airway hyperresponsiveness and inflammation[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2014.

[23] Haider BA， Baras AS， McCall MN，et al. A Critical evaluation of microRNA biomarkers in non-neoplastic disease[J].PLoS One， 2014， 9：e89565.

[24] Mitchell PS， Parkin RK， Kroh EM，et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U S A， 2008，105：10513-10518.

[25] Wang JW， Li K， Hellermann G，et al. Regulating the regulators：microRNA and asthma[J].World Allergy Organ J， 2011，4：94-103.

[26] Pauley KM， Cha S. RNAi therapeutics in autoimmune disease[J].Pharmaceuticals (Basel)， 2013，6：287-294.

[27] Lanford RE， Hidebrandt-Eriksen ES， Petri A， et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection[J].Science， 2010， 327：198-201.

[28] Mattes J， Collison A， Plank M，et al. Antagonism of microRNA-126 suppresses the effector function of TH2 cells and the development of allergic airways disease[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2009，106：18704-18709.

[29] Fujita Y， Takeshita F， Kuwano K， et al. RNAi therapeutic platforms for lung diseases[J].Pharmaceuticals (Basel)， 2013，6：223-250.