副猪嗜血杆菌的分离与血清型鉴定

于 江，吴家强，张玉玉，陶海英，王金宝＊

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100；3.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100）

副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）是定居于健康猪的上呼吸道的常在菌，但在特定条件下可以侵入机体，引起发病猪的多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等疾病［1］。近年来，随着我国养猪业规模化和集约化发展，该病以继发的方式存在于各规模化猪场，并呈逐年上升趋势，增加了断奶到保育阶段仔猪的发病率及死亡率，对养猪业造成巨大的经济损失，已逐渐成为世界范围的重要疾病［2］。

HPS的血清型复杂多样，按Kieletein－Rapp－Gabriedson（KRG）琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型［3］。蔡旭旺等［4］研究表明我国以血清4型（24.2%）和5型（19.2%）最为流行，其次为13型（12.5%），14型（7.1%）和12型（6.8%），另外有12.1%的分离菌株不能进行血清学分型［4］。

近几年，HPS在我国各地猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，已从不同地区分离出该菌，损失相当惨重［5］。臧莹安等［6］对广东省部分猪场进行了HPS流行病学调查，结果表明不同猪场感染HPS的阳性率是不同的。白刚等［7］对宁夏四个地区未接种HPS疫苗猪场的403份猪血清进行了HPS的血清抗体检测，结果发现宁夏不同地区流行情况各有差异，且4～10周龄的仔猪感染HPS的比率最高。

本研究采用细菌分离培养结合PCR 检测的方法，对2008年至2012年送检的来自山东、河南、河北、湖南、江苏、上海的多个猪场的186份样品进行HPS的分离鉴定，用琼脂扩散试验对分离菌株的血清型进行鉴定，分析该病的发生与季节和猪日龄的关系，以了解副猪嗜血杆菌病的流行情况，为该病的综合防控及治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

从2008年至2012年，于山东、河南、河北、湖南、江苏、上海的多个猪场采集鼻拭子及发病猪场的疑似病例（包括发病猪、病死猪或发病猪的脑、肺脏、关节、心脏），共186份。

1.2 主要试剂与仪器

HPS标准阳性血清：由山东省农业科学院畜牧兽医研究所保存、提供；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）为美国BD 公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）为Sigma公司产品；新生牛血清购自济南劲牛公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000购自大连宝生物工程有限公司。恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；PTC－2000 型PCR 仪购自美国MJ Research公司。

1.3 PCR 引物

根据Oliveira等［15］报道，由上海生物工程有限公司合成1对特异引物。

上游引物：5＇－GTGATGAGGAAGGGTGGTGT－3＇；下游引物：5＇－GGCTTCGTCACCCTCTGT－3＇。预期扩增的片段大小为822bp。

1.4 菌株的分离培养及形态学观察

无菌采集多个猪场的鼻拭子及疑似HPS病的发病猪病料（如脑、肺脏、心包液、心血、关节液），划线接种于含10mg／mL NAD 和5%新生牛血清的TSA 培养基上，置于37 ℃培养箱培养36～72h，观察细菌菌落特征，挑取圆形、光滑湿润、无色透明的露珠样菌落进行革兰氏染色镜检，将镜检为可疑的菌落进行纯培养。

1.5 PCR 扩增

采用直接煮沸法从HPS分离株培养物中提取DNA［4］，PCR扩增方法按于江等［9］描述的方法进行。

1.6 菌株的血清型鉴定方法

根据蔡旭旺等［4］方法制备各分离菌株的血清学分型抗原，以各血清型标准血清对各分离株进行琼脂扩散试验，以确定各分离株的血清型，统计HPS分离的阳性率。阳性率＝（阳性数／分离株数）×100%。

1.7 统计处理

各组之间差异用ANOVA 进行分析，比较不同时间和不同年龄段猪HPS的感染阳性率，P＜0.05表示差异显著，分析HPS分离菌株不同血清型流行病学调查情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离培养

分离培养获得57株疑似HPS分菌株，并在含10mg／mL NAD 和5%新生牛血清的TSA 培养基长出较多的圆形、光滑湿润、无色透明的露珠状小菌落（图1A）。取上述菌落涂片革兰氏染色后在显微镜下观察，细菌为革兰氏阴性的细小杆菌，呈球杆状、短杆状、长杆状、间或丝状等多种形态（图1B）。

2.2 病原菌PCR 扩增结果

用HPS特异性引物进行PCR 扩增，结果发现57株疑似HPS分菌株均扩增获得了长度为822bp的DNA 片段，与目的片段大小一致（图2）。

图1 HPS分离株在TSA 培养基上的菌落形态及显微镜下细菌形态Fig.1 The colony morphology in TSA and bacteria morphology under microscope of HPS isolated strains

2.3 血清型鉴定

将分离出的57株HPS，采用琼脂扩散试验进行血清学分型，结果如表1所示。2株分离株不能确定血清型，而在55 株可以确定血清型的分离株中，血清4型和5 型阳性率相对较高，其次是血清1、12、13型，而血清14型分离到3株，血清2、6、、8、10、11型各分离到2株，血清3、9型各分离到1株，血清7型和15型目前尚未分离到。

2.4 不同时间HPS分离菌株的检测结果

从2008～2012年共检测186 份样品，其中57份为HPS阳性。该病主要集中于每年的3、4、10、11、12月份（P＜0.05），说明该病春季、秋季、冬季的发病率要高于夏季。各月份检测阳性率见表2。

图2 HPS分离株的PCR 扩增结果M.DL2000 Marker；1.HPS分离菌株；2.阳性对照；3.阴性对照Fig.2 PCR amplification of HPS isolated strainsM.DL2000 Marker；1.HPS isolated strain；2.Positive control；3.Negative control

表1 HPS分离菌株血清型鉴定结果Table 1 Serotype identification results of HPS isolated strains

表2 不同月份HPS分离菌株的检出情况Table 2 The detection of HPS isolated strains in different month

2.5 不同日龄猪HPS感染情况

统计57份HPS阳性的样品的日龄，其中0～30日龄有18例，31～50日龄有28例，51～80日龄有8例，81日龄以上有3例。可以看出，HPS主要感染保育舍的3l～50日龄（即4～7周龄）的小猪。

3 讨论

HPS是猪上呼吸道的一种常在菌，在特定条件下可以侵入机体引起全身性疾病［10］。该菌可以影响2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%［11］。

HPS的血清型复杂多样，目前已知有15个血清型，但国内外各地流行的血清型不尽相同，这给该病的防治带来了极大的困难。本研究从186份新鲜样品中共分离鉴定得到57株HPS分离株，血清型鉴定结果表明，血清4型和5型是该菌流行的优势血清型，其次是血清1、12、13、14 型；这与蔡旭旺等［4］的研究结果稍有不同，可能是由于地域不同，环境差异等条件的限制。

尽管江西、湖北等省份的调查结果均显示不同地区的HPS感染程度不同，但江西省HPS阳性率范围为15～45%，湖北省HPS 阳性率范围为0～58%［12－13］。本研究中HPS分离的阳性率为30.6%，与上述两省的结果基本一致。

本研究还发现副猪嗜血杆菌病春、秋、冬季的发病率要高于夏季，且多发于4～7周龄的保育猪，这与尹秀凤等［14］的研究结果是一致的，这为猪场防治本病提供了一定的帮助。了解HPS血清型的流行情况，明确该病多发的季节与猪的日龄，为HPS疫苗菌株血清型的筛选及该病的防治提供了重要的参考依据。

［1］Oliveira S，Pijoan C.Haemophilusparasuis：new trends on dignosis，epidemiology and control［J］.Veterinary Microbiology，2004，99（1）：1－12.

［2］刘正飞，蔡旭旺.副猪嗜血杆菌研究进展［J］.动物医学进展，2003，24（5）：17－19.

［3］Kielstein P，Rapp－gabrielson V J.Designation of 15serovars ofHaemophilusparasuison the basis of immunodiffusion using heat－stable antigen extracts［J］.Journal of Clinical Microbiology，1992，30（4）：862－865.

［4］蔡旭旺，刘正飞，陈焕春，等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定［J］.华中农业大学学报，2005，24（1）：55－58.

［5］冼琼珍，黄耿森，王淑敏，等.副猪嗜血杆菌的分离鉴定［J］.中国兽医杂志，2006，42（3）：27－28.

［6］臧莹安，庞木生，黄彩梅，等.广东部分猪场副猪嗜血杆菌病的流行病学调查［J］.中国兽医杂志，2012，48（4）；18－20.

［7］白 刚，贺 英，赵 萍，等.宁夏部分地区副猪嗜血杆菌病的血清学调查［J］.甘肃畜牧兽医，2010，40（4）：3－6.

［8］Oliveira S，Galina L，Pijoan C.Development of a PCR test to diagnoseHaemophilusparasuisinfections［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2001，13：1 495－1 501.

［9］于 江，吴家强，张玉玉，等.副猪嗜血杆菌荧光定量PCR 检测技术的建立与应用［J］.家畜生态学报，2010，34（4）：77－81.

［10］赵 萍，贺 英，储岳峰，等.江西省部分猪场副猪嗜血杆菌病血清学调查［J］.动物医学进展，2009，30（12）：107－109.

［11］华 升，梅书棋，曾德芳，等.副猪嗜血杆菌病研究进展［J］.动物医学进展，2006，27（11）：7－10.

［12］杨 群，万培伟，周泉勇，等.江西省部分地区副猪嗜血杆菌血清学调查［J］.江西畜牧兽医杂志，2014，1：55－56.

［13］高鹏程，贺 英，储岳峰，等.湖北省部分地区猪场副猪嗜血杆菌病的血清学调查［J］.湖北农业科学，2009，48（4）：926－928.

［14］尹秀凤，王 艳，姜 平，等.我国部分地区副猪嗜血杆菌病的流行病学调查［J］.畜牧与兽医，2007，39（6）：11－13.