南疆地区四个家鸡群体微卫星标记的遗传多样性研究

吾买尔江·艾孜木，齐·阿拉达尔，程 龙，王 永，刘永宏，努尔古丽·玉素甫，格明古丽·木哈台＊

（1.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300；2.中科院新疆地理与生态研究所系统基因组学实验室，新疆乌鲁木齐830011；3.林肯大学农业与生命科学系，新西兰坎特伯雷84850；4.和静县和静镇畜牧兽医站，和静，新疆841300，China）

中国家鸡品种多、分布广、遗传多样性非常丰富，但由于保种不当，商业品种的大量推广和杂交，使原有家鸡种类和数量减少、濒临灭绝或已灭绝。因此，对家鸡遗传资源的保存和管理已成为当务之急。分子生物学技术是遗传资源保存研究中必不可少的技术手段之一，通过对DNA 多态性的分析，研究种群间的亲缘关系及遗传多样性，有助于了解品种的进化历史、分类地位和相互关系，为生物资源的保存利用提供理论依据［1－6］。

微卫星是指以少数几个核苷酸DNA 序列，具有高度保守性和位点多态性，广泛且均匀分布于真核生物基因组中。微卫星标记作为第2代分子遗传标记，具有分布广泛、多态信息含量高、呈共显性遗传及检测快速方便等优点，因此在鸡遗传多样性研究中得到广泛的应用［7－18］。联合国粮农组织（FAO）［19］在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中，也将微卫星标记作为优先推荐的分析工具。目前微卫星标记已经成为群体遗传结构、遗传多样性研究中最普遍最有效的工具之一。

据资源调查发现，新疆和静县、拜城县、阿合奇县和塔什库尔干县偏远的乡村遗留一些家鸡群。拜城县隶属于新疆维吾尔自治区阿克苏地区，位于天山中段南麓。地势北高南低，由西北向东南倾斜。北以天山为界与伊犁地区昭苏县、特克斯县接壤，南以却勒塔克山与新和县相连，东与库车县、和静县毗邻，西以木扎提河与温宿县相望。县内野生动、植物品种繁多，主要分布在天山山区。和静县位于新疆中部，天山中段南麓，巴音郭楞蒙古自治州西北地区，焉耆盆地西北部，周边与乌鲁木齐市、库尔勒市等17个县市毗邻。塔什库尔干塔吉克自治县位于帕米尔高原东部，喀喇昆仑山北部。东与叶城县、莎车县交界，北与阿克陶县毗邻，南、西分别与克什米尔（巴基斯坦实际控制区）、阿富汗、塔吉克斯坦接壤（边境线长808km），平均海拔在4 000m 以上。昆仑山、喀喇昆仑山、兴都库什山和天山四大山脉在此处汇合，形成“世界屋脊”。阿合奇县位于新疆维吾尔自治区西部的天山南脉腹地，阿合奇县地处克孜勒苏柯尔克孜自治州东北部。东邻乌什县，东南、南部分别与阿克苏地区的柯坪县、喀什地区的巴楚县接壤，西南与阿图什市毗连，北部、西部与吉尔吉斯斯坦交界，国界线长达286.7km。全县地处高寒山区。这四个县相间的距离300～1 300km。为进一步揭示四个县家鸡间的遗传距离，用微卫星标记的方法进行遗传多样性的研究。本研究由GenBank选择多态性较好的20对微卫星引物，用STR 分型检测天山南段存有的3个家鸡和昆仑山脉的1个家鸡中进行遗传变异的分析，并计算各品种之间的遗传距离，以揭示其亲缘关系及遗传多态性，为品种选择与保护、杂交育种等提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新疆天山南段的和静县、拜城县、阿合奇县及塔什库尔干县等偏远的山区乡村中筛选典型的家鸡203只（和静家鸡47只，拜城油鸡49 只，阿合奇县家鸡58 只和塔什库尔干县家鸡49 只）。用自带EDTA 抗凝剂采血管，每只鸡翅下静脉采血2～3 mL，－70 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 用艾德莱生物小量全血基因组DNA 快速提取试剂盒提取基因组DNA。提取的基因组DNA 经紫外分光光度法检测其纯度和浓度，稀释成50ng／μL 用于PCR 扩增模板。

1.2.2 微卫星引物合成及PCR 扩增 选择韩健林［1］等报道的20对微卫星，其引物序列见表1。引物由北京阅微基因技术有限公司合成。PCR 扩增体系15μL：包含模板DNA 50ng，10×PCR Buffer 1.5μL，上、下游引物（10μM）各1.5μL ，Taq酶（5U／μL）0.15μL，加ddH2O 补齐15μL。反应条件：94℃预变性4min，94℃变性，30s，58℃退火30s，72 ℃延伸30s，35个循环，最后60 ℃延伸30 min。PCR 产物用1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测。用纯化试剂盒纯化PCR 产物，取1.0μL 纯化PCR产物，加入9μL分子量内标和甲酰胺混合液（0.5∶8.5），95 ℃变性3min，用3730XL测序仪检测条带大小和数目，将检测得到的原始数据文件导入到分析软件中进行分析。

表1 20对微卫星（STR）DNA 标记的引物信息Table 1 Primer information of the 20microsatellite（STR）DNA markers

1.2.3 统计分析 利用POPGEN 3.2（http：／／www.ualberta.ca／～fyeh）进行群体遗传学分析，计算微卫星位点的等位基因频率（Nf）、等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和Shannon多样性指数（I）；利用Cervus 3.0软件计算多态信息含量（PIC），PIC＜0.25为低度多态，0.25≤PIC＜0.50 为中度多态，PIC≥0.50为高度多态。利用POPGEN 3.2计算群体间的Nei＇s 遗传距离，并基于该遗传距离用PHYLIP 3.5软件构建UPGMA 系统发生树。

2 结果

2.1 微卫星基因座的多态性分析

20个微卫星位点观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon 多样性指数（I）和多态信息指数（PIC），结果见表2。

表2 20个微卫星标记的多态特征Table 2 Characteristics of 20STRs in four Xinjiang indigenous chickens

由表2可知，四个家鸡品种的平均观测等位基因数为14.65，其中LEI0234 最多（Na＝28），MCW0037最少（Na＝7）；有效等位基因数平均值为4.7，最高为13.229（LEI0234），最低为2.178（MCW0248）；观测杂合度平均值为0.593，最高为0.833，最低为0.455；期望杂合度平均值为0.757，最高为0.927，最低为0.542；Shannon多样性指数平均值1.753，LEI0234 最高为（I＝2.801），MCW0248位点最低（I＝1.030）；多态信息含量介于0.487～0.920，平均值为0.723，除MCW0248位点PIC为0.487外，其它19个位点的PIC值均大于0.5，为高多态性位点。

2.2 群体遗传距离及聚类分析

4个家鸡品种群体遗传多样性如表3 所示。和静黑鸡的平均等位基因数最多（Na＝9.6）；阿合奇家鸡的平均观测杂合度最高（Ho＝0.652）；拜城油鸡的平均期望杂合度、多态性息含量及Shannon 多样性指数均为最高（He＝0.757；PIC＝0.722；I＝1.678）。塔什库尔干家鸡的各项指数在4个家鸡品种中均最低（Na＝8.2；Ho＝0.517；He＝0.702；PIC＝0.663；I＝1.512）。四个家鸡品种的PIC均超过了0.5（0.663－0.722），差异显著（P＜0.05），表明4个不同品种的家鸡群体内部均具有较高的遗传多样性。

表3 四种新疆地方鸡群体多样性Table 3 Genetic diversity of four Xinjiang indigenous chickens

表4 四种鸡的Nei氏遗传距离和遗传一致度Table 4 Nei＇s genetic distance and genetic identity

图1 根据Nei氏遗传距离的UPGMA 系统聚类图Fig.1 UPGMA phylogenetic tree by Nei＇s genetic distance

AMOVA 分析显示群体间遗传差异不显著（P＞0.05）。其中拜城县家鸡和阿合奇家鸡群体间遗传差异最小，塔什库尔干鸡与其它三个家鸡群体之间的遗传差异均大于拜城县家鸡（拜城油鸡）、阿合奇家鸡、和静黑家鸡之间的遗传差异。运用Nei氏遗传距离构建的UPGMA 系统聚类图显示，塔什库尔干鸡属于一个单独的分支（图1），塔什库尔干鸡与其他群体的遗传距离都较远，与其他群体的遗传一致度较低，见表4。四个家鸡群遗传一致度大于0.8672，显示出较高的遗传一致度。从遗传距离上来看，拜城油鸡和阿奇鸡的遗传距离最近，为0.0807。其次拜城油鸡和阿合奇家鸡与静黑鸡近一些。塔什库尔干家鸡与其他三个家鸡距离较远，分别为0.1412、0.1362、0.1425，结果符合各生态地理。

3 讨论

本研究利用20 个微卫星DNA 标记对对新疆天山山脉南段的和静县、拜城县、阿合奇县和帕米尔高原的塔什库尔干县家鸡的203 个样本进行分析。测定结果PIC为0.487～0.92，平均值0.72，表示20个微卫星座位的多态性都较高。一般认为，PIC值大于0.5时，认为高度多态性；若多态信息指数介于0.25和0.5之间，为中度多态性；若PIC小于0.25，为低多态性。4个不同品种的家鸡群体内部均具有较高的遗传多样性，其中塔什库尔干鸡的杂合度和多态性最低，原因是塔什库尔干地理环境比较特殊，恶劣的气候环境和高原气候其他外来品种很难适应，与外界的基因交流较少，导致遗传多样性低。四个群体之间比较看，群体间遗传差异不显著，其中拜城县家鸡（拜城油鸡）和阿合奇家鸡的遗传差异最低，塔什库尔干鸡与其它三个品种家鸡之间的遗传差异均大于拜城县家鸡（拜城油鸡）、阿合奇家鸡、和静黑家鸡之间的遗传差异。塔什库尔干鸡在相对隔绝的条件下，逐渐演变为一个较为独立的品种。

拜城油鸡和阿合奇鸡的遗传距离最近，为0.0807。而和静黑鸡与其他两种鸡的距离比塔什库尔干鸡近一些。在聚类图中证明了这一点，塔什库尔干家鸡均聚于一个独立的分支，从其地理分布来看，塔什库尔干家鸡离阿合奇县直线距离800km以上，与拜城县1 200km 以上，与和静县1 600km以上，地处高海拔（4 000m 以上）帕米尔高原，据取证调查塔什库尔干家鸡主要来自巴基斯坦、阿富汗和乌兹别克斯坦等国家，所以塔什库尔干鸡是在特殊的地理、历史和气候条件下孕育出的独特地方鸡种。拜城县和阿合奇县家鸡出现在一个分支上的原因是地理位置比较近（直线距离300以上），都在天山脉，所以一个品种的可能性大。和静县家鸡与拜城县家鸡和阿合奇县家鸡聚的分支比较近，因为和静县也处于天山脉，但和静家鸡受外来鸡中的影响比较大，表型遗传上也可以看出来。

4 结论

新疆天山南段的四种家鸡间的微卫星标记结果揭示了它们的遗传距离，以前认为拜城油鸡只有拜城县所有，但邻近的阿合奇县家鸡遗传距离与拜城油鸡比较近，和静县家鸡也属于天山山脉家鸡种，但和静县家鸡被商业品种鸡杂化后形成了现在的外貌及生产性能上有差别的新的培育品种，而塔什库尔干县家鸡是独立的一个新发现的地方品种，因此和静县家鸡和塔什库尔干县家鸡需要深一步研究、保护开发利用。

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