含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物的合成及抑菌活性

马延龙，周如金,*，曾兴业，邱松山，聂丽君

含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物的合成及抑菌活性

马延龙1,2，周如金1,2,*，曾兴业2，邱松山2，聂丽君2

（1.江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏 镇江 212003；2.广东石油化工学院化学工程学院，广东 茂名 525000）

以顺、反丁烯二酸单酯和o,m,p-羟基苯甲酸甲酯为起始原料合成了6 种新型的含羟基苯甲酸甲酯单元的顺、反丁烯二酸酯类化合物，目的在于发现新的具有抑制食品相关细菌和真菌生长能力的生物活性分子。产物结构经液相色谱-质谱联用（liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）表征和元素分析。体外抑菌活性实验结果表明，所有合成的化合物对8 种供试菌有着较好的抑菌效果，化合物4a的抑菌活性最强（最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）≤75 μg/mL），化合物4a对酿酒酵母、黄曲霉和产黄青霉的MIC分别为25、37.5、37.5 μg/mL。

顺、反丁烯二酸酯类化合物；合成；抑菌活性

α,β-不饱和羰基化合物是化学工业中重要的有机物质，被广泛应用于合成化学品、药物、溶剂、食品添加剂和消毒剂。由于α与β的碳碳双键和羰基碳氧双键之间具有共轭作用，导致β-碳具有部分正电荷，致使亲核基团更容易进攻β-碳，因此能与含有富电子基团的生物大分子多肽、蛋白质和DNA发生Michael加成反应[1-5]，使生物大分子的结构发生改变，以致扰乱其生物活性。富马酸酯类化合物就属于这一类化合物且具有较强的生物活性[6-8]，通常作为食品添加剂用于食品行业或作为临床药物用于治疗牛皮癣和多发性硬化症[9-10]。但是富马酸酯类化合物对人体有一定的刺激反应[11]，限制了其应用。为了克服此缺点并保留其活性中心——α,β-不饱和羰基结构，国内研究者主要以顺、反丁烯二酸为母体结构，一端引入甲酯，另一端引入海藻糖、甘油、VC、苯环、长链烷烃等取代基[12-17]，以降低刺激反应。

羟基苯甲酸酯类化合物在食品和药物行业中也具有重要的作用，其中对羟基苯甲酸甲酯被公认为是相对安全的化学品，具有低成本、低毒性和抗菌谱广等特性，因而被广泛应用于化妆品和食品行业[18-19]。因此将顺、反丁烯二酸单酯类化合物和羟基苯甲酸酯类化合物结合，合成新的α,β-不饱和羰基化合物，不仅可以降低富马酸酯类化合物对人体的负面影响，而且还可以增强其抑菌活性。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种（S. choleraesuis subsp. choleraesuis ATCC 13312）、乳酸链球菌乳亚种（L. lactis subsp. lactis ATCC 11454）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis ATCC 6633）、白假丝酵母菌（C. albicans ATCC 10231）、酿酒酵母（S. cerevisiae ATCC 9763）、黄曲霉（A. flavus CICC 40191）、黑曲霉（A. niger CICC 2273）、产黄青霉（P. chrysogenum CICC 4017），由广东石油化工学院食品系提供。

细菌NB培养基：葡萄糖1%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2。真菌SDA固体培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂2%，pH值自然。真菌SDB液体培养基无琼脂。

所用试剂均为市售化学纯，无水四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）由金属钠蒸馏制备。

1.2 仪器与设备

DSC-500BL差示扫描量热仪 上海盈诺精密仪器有限公司；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）（SPD-20A，LC-20AT）、LC/MS-2020型液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS）（ESI离子源） 日本岛津公司；AVANCEⅡ400核磁共振仪（nuclear magnetic resonance，NMR）（二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）-d6（δH=2.51, δC=39.5, δH=3.34, H2O）为溶剂，四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）为内标） 瑞士Bruker公司；Vario EL CUBE 元素分析仪 德国Elmentar公司。

1.3 方法

1.3.1 表征方法

HPLC测试方法：流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，流动相为CH3OH-H2O（水中含有0.5%的甲酸）= 80∶20（V/V），进样量为10 μL。LC-MS测试方法：流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，流动相为A：0.1% HCOOH-H2O，B：0.1% HCOOH-CH3CN，梯度洗脱，正负离子扫描，进样量为5 μL。

1.3.2 含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物的合成

以顺、反丁烯二酸单酯和o,m,p-羟基苯甲酸甲酯为起始原料合成含羟基苯甲酸甲酯单元的顺、反丁烯二酸酯类化合物，合成路线如图1所示。在低温条件下，将草酰氯（1.7 g、13 mmol）逐滴加入到马来酸单甲酯（1.1 g、8.5 mmol）、2 滴二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）和无水THF（20 mL）的混合液中，室温条件下搅拌2 h，反应结束后，旋转蒸馏除去溶剂与残留的草酰氯，得（Z）-甲基-4-氯-4-羰基-2-丁烯酸酯，加入10 mL无水THF得酰氯混合液。在0 ℃条件下，将酰氯混合液逐滴加入到邻羟基苯甲酸甲酯（1 g、6.6 mmol）与NaH（0.32 g、13 mmol）在无水THF（15 mL）的反应液中，室温搅拌1～2 h，TLC检测，反应完之后，用稀盐酸（1 mol/L）调节pH值至4，旋转蒸馏除去溶剂，水相用乙酸乙酯萃取（共3 次，每次20 mL），合并有机相用饱和盐水（20 mL）洗涤，经无水硫酸钠干燥后过滤，蒸馏除去乙酸乙酯得无色油状液体，硅胶层析柱对产物分离纯化（乙酸乙酯-石油醚体积比10∶1），得化合物1。

其他化合物采用相同的合成方法。

图1 含羟基苯甲酸甲酯单元的顺、反丁烯二酸酯类化合物的合成路线Fig.1 Synthetic route of cis/trans-but-2-enedioic acid esters containing a hydroxybenzoic acid methyl ester moiety

1.3.3 抑菌活性分析

1.3.3.1 菌悬液的制备

猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种和乳酸链球菌乳亚种接种于NB培养基37 ℃培养24 h，枯草芽孢杆菌接种于NB培养基在30 ℃培养24 h，之后稀释至0.5麦氏比浊度（OD625nm=1.1～1.3），浓度约108CFU/mL[20]；酵母接种于SDB培养基30 ℃培养24 h后，稀释至0.5麦氏比浊度（OD530nm=1.1～1.3），浓度约106CFU/mL[21]；霉菌接种于SDA斜面培养基28 ℃培养5 d后，用无菌生理盐水（0.85%）冲洗并调至0.5麦氏比浊度（OD530nm= 1.3～1.5），孢子浓度约为106CFU/mL[22]。然后用相应的培养基将细菌悬液、酵母悬液和孢子悬液以1∶50稀释至最终浓度104CFU/mL。

1.3.3.2 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定

含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物和对照药品（富马酸单甲酯（monomethyl fumarate，MMF）和对羟基苯甲酸甲酯（methyl 4-hydroxybenzoate，MP））溶于DMSO中，然后加入到以上稀释好的菌悬液中，使之最终质量浓度分别为18.75、25、37.5、50、75、100、150、200 μg/mL和100、200、300、400、600、800 μg/mL。细菌和酵母在对应的培养条件下培养24 h，霉菌在SDB培养基中培养48 h。DMSO在培养基中的最终浓度不超过2%。在强光下，清澈透明、无可见微生物生长，化合物的质量浓度最低值即为MIC值。所有实验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物结构的表征

2-（甲氧基羰基）苯基甲基马来酸酯的合成（化合物1）：1.20 g白色固体，产率69%，熔点（melting point，mp）：45～46 ℃，HPLC（254 nm）：98.9%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 7.98（dd, J=7.8, 1.6 Hz, 1H)、7.73（td, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H）、7.46（td, J =7.7,1.1 Hz, 1H）、7.35（dd, J = 8.1, 0.8 Hz, 1H）、7.01 （d, J = 0.5 Hz, 2H）、3.79（s, 3H）、3.76（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 164.90、164.40、163.27、149.62、134.88、134.72、132.41、131.54、127.04、124.08、122.84、52.67、52.53；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH3]-；C13H12O6元素分析计算值：C 59.09，H 4.58；实测值：C 58.23，H 4.69。

2-（甲氧基羰基）苯基甲基富马酸酯（化合物2）：1.30 g白色固体，产率74.7%，mp：47～48 ℃，HPLC（254 nm）：97.9%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 7.99（dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H）、7.74（td, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H）、7.47（td, J = 7.7, 1.0 Hz, 1H）、7.36（dd, J = 8.1, 0.8 Hz, 1H）、7.01 （s, 2H）、3.80（s, 3H）、3.77（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 164.66、164.16、163.03、149.39、134.64、134.47、132.18、131.30、126.79、123.84、122.61、52.43、52.28；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH3]-；C13H12O6元素分析计算值：C 59.09，H 4.58；实测值：C 58.20，H 4.56。

3-（甲氧基羰基）苯基甲基富马酸酯（化合物3）：1.26 g白色固体，产率72.4%，mp：75～76 ℃，HPLC（254 nm）：96%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 7.93～7.87（m, 1H）、7.84～7.79（m, 1H）、7.63（t, J = 7.9 Hz, 1H）、7.55（ddd, J = 8.1, 2.2, 1.0 Hz, 1H）、7.00（s, 2H）、3.87（s, 3H）、3.80（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.33、164.67、162.92、150.07、134.41、132.40、131.09、130.17、126.94、126.59、122.31、52.41、52.37；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH3]-；C13H12O6元素分析计算值：C 59.09， H 4.58；实测值：C 59.41，H 4.71。

4-（甲氧基羰基）苯基甲基富马酸酯（化合物4a）：1.50 g白色固体，产率86.2%，mp：111～112 ℃，HPLC（254 nm）：96.6%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 8.08～8.05（m, 1H）、8.05～8.03（m, 1H）、7.43～7.41（m, 1H）、7.41～7.38（m, 1H）、7.01（s, 2H）、3.87（s, 3H）、3.79（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.45、164.63、162.61、153.66、134.63、132.28、130.84、127.57、122.08、52.44、52.25；MS（ESI）m/z 248.8 [MCH3]-；C13H12O6元素分析计算值：C 59.09，H 4.58；实测值：C 57.68，H 4.79。

4-（甲氧基羰基）苯基乙基富马酸酯（化合物4b）：1.42 g白色固体，产率77.6%，mp：69～70 ℃，HPLC（254 nm）：97.3%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 8.07～8.05（m, 1H）、8.05～8.03 （m, 1H）、7.43～7.41（m, 1H）、7.41～7.38（m, 1H）、6.99（s, 2H）、4.25（q, J = 7.1 Hz, 2H）、3.87（s, 3H）、1.28（t, J = 7.1 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.44、164.10、162.60、153.66、134.95、132.12、130.82、127.55、122.06、61.26、52.22、13.89； MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH2CH3]-；C14H14O6元素分析计算值：C 60.43，H 5.07；实测值：C 60.23，H 5.05。

4-（甲氧基羰基）苯基丙基富马酸酯（化合物4c）：1.50 g白色固体，产率78.1%，mp：59～60 ℃，HPLC（254 nm）：98.2%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 8.07～8.05（m, 1H）、8.05～8.02 （m, 1H）、7.43～7.41（m, 1H）、7.41～7.38（m, 1H）、7.00（s, 2H）、4.17（t, J = 6.6 Hz, 2H）、3.87（s, 3H）、1.73～1.59（m, 2H）、0.94（t, J = 7.4 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.44、164.18、162.61、153.67、134.92、132.13、130.82、127.55、122.06、66.61、52.22、21.37、10.14；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH2CH2CH3]-；C15H16O6元素分析计算值：C 61.64，H 5.52；实测值：C 61.12，H 5.40。

2.2 含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物的合成

合成2-（甲氧基羰基）苯基甲基马来酸酯（化合物1）的过程中，采用了Na2CO3、三乙胺、吡啶和NaH作为缚酸剂，THF和二氯甲烷（dichloromethane，DCM）为溶剂，其他反应条件不变，薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）检测显示NaH作为缚酸剂时，才有产物生成（表1）。由此可以推断，邻羟基苯甲酸甲酯中羟基氢与羰基之间形成了氢键，氢离子被束缚不易离去；甲酸甲酯的吸电子效应降低了羟基氧的电子密度，导致羟基的亲核能力降低，二者的共同作用使得邻羟基苯甲酸甲酯与酰氯的反应活性降低或者很难发生反应。选用强碱NaH与邻羟基苯甲酸甲酯反应生成盐离子，破除氢键，增强氧的亲核性，促使氧离子与酰氯发生反应，生成产物和NaCl，而不是醇与酰氯反应生成产物与HCl，HCl与缚酸剂结合促进反应平衡向产物方向移动。为保持实验的一致性，其他化合物采用相同的方法合成。

表1 缚酸剂对醇解反应的影响Table 1 Effect of different acid-binding agents on the alcoholysis reaction

2.3 含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物的结构分析

图2 化合物1和化合物2的1H NMR（a）和13C NMR（b）谱图Fig.21H NMR (a) and13C NMR (b) spectra of compounds 1 and 2

化合物1～3、4a～4c的1H NMR谱图中，苯环质子峰在δ 7.35～8.08范围内，不饱和双键的质子峰在δ 7.00左右且表现为单峰；13C NMR谱图中，酯碳的特征峰在δ 162～165左右，苯环和不饱和双键的碳峰在δ 122～153范围内。由图2可知，化合物1和2 的1H NMR和13C NMR谱图极其相似，难以区分。但是它们的熔点不同，化合物1的熔点为45～46 ℃，化合物2的熔点为47～48 ℃，因此可依据熔点分辨化合物1和2。

2.4 抑菌活性

化合物1～3、4a～4c和对照药品（富马酸单甲酯和对羟基苯甲酸甲酯）对8 种供试菌的最低抑菌浓度见表2。结果表明：相比于MMF和MP，化合物1～3、4a～4c对供试菌的抑菌活性更强；绝大多数化合物在200 μg/mL内能抑制供试菌的生长；化合物1～3、4a～4c对真菌和革兰氏阳性菌的抑菌活性明显强于革兰氏阴性菌。尤其值得注意的是：反式化合物2的抑菌活性强于顺式化合物1；对位化合物4a的抑菌活性强于邻位化合物2和间位化合物3；化合物4a、4b和4c的抑菌活性结果显示烷基链的长度能显著的改变抑菌活性，随着烷基链的增加，MIC值也随之增大。综合以上结果，4-（甲氧基羰基）苯基甲基富马酸酯（4a）的抑菌活性最强，而且对细菌和真菌都有着较好的抑菌效果，也意味着化合物4a可作为潜在的食品防腐剂。

表2 化合物1～3、4a～4c和对照药品的体外抑菌活性Table 2 in vitro antimicrobial activities of compound 1 through 3 and 4a through 4c, and reference drugs

3 结 论

本实验以顺、反丁烯二酸单酯和o,m,p-羟基苯甲酸甲酯为起始原料合成了6 种新型的含羟基苯甲酸甲酯的顺、反丁烯二酸酯类化合物。抑菌实验结果表明，化合物1～3、4a～4c对供试菌有着较好的抑菌效果，其抑菌活性强于富马酸单甲酯和对羟基苯甲酸甲酯。尤其是化合物4a对供试菌的抑菌活性最强（MIC≤75 μg/mL），可作为潜在的食品防腐剂。

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Synthesis and Antimicrobial Activity of Novel cis/trans-But-2-Enedioic Acid Esters Containing a Hydroxybenzoic Acid Methyl Ester Moiety

MA Yan-long1,2, ZHOU Ru-jin1,2,*, ZENG Xing-ye2, QIU Song-shan2, NIE Li-jun2
(1. School of Biological and Chemical Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212003, China; 2. College of Chemical Engineering, Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000, China)

Six novel cis/trans-but-2-enedioic acid esters containing a hydroxybenzoic acid methyl ester moiety were synthesized as potential food preservatives, aiming to discover the new bioactive molecules that can kill food-related bacteria and fungi, and their structures were characterized by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) and elemental analysis. The antimicrobial activity assays in vitro showed that these compounds had strong bioactivity against all eight microorganisms tested. Among the most promising antibacterial and antifungal compounds, 4-(methoxycarbonyl) phenyl methyl fumarate (4a) showed the best antimicrobial activity, and it was effective against S. cerevisiae, A. fl avus and P. chrysogenum with minimal inhibition concentration (MIC) of 25, 37.5 and 37.5 μg/mL, respectively.

cis/trans-but-2-enedioic acid esters; synthesis; antimicrobial activity

TS202.3

A

1002-6630（2014）17-0118-05

10.7506/spkx1002-6630-201417024

2013-10-25

广东省教育部产学研结合项目（2009B090300134）；广东省高等学校高层次人才项目

马延龙 （1988—），男，硕士研究生，研究方向为有机食品防腐剂。E-mail：ma880927@163.com

*通信作者：周如金（1965—），男，教授，博士，研究方向为有机食品。E-mail：rujinzhou@126.com