来曲唑联合依维莫斯对人子宫内膜癌细胞的体外抑制作用及机制

杨 尧，陆晓媛

(1徐州医学院，徐州221000;2徐州医学院附属医院)

子宫内膜癌为女性生殖系统常见三大恶性肿瘤之一，近年来发病率有上升趋势。其确切病因目前仍无定论，大多数学者认为与长期持续的雌激素刺激且无孕激素拮抗有关［1］。绝经后女性雌激素主要由肾上腺皮质分泌的雄烯二酮经芳香化酶作用转化而来［2］，芳香化酶抑制剂能抑制芳香化酶的活性，降低由雄激素转化的雌激素水平，进一步阻断雌激素刺激肿瘤细胞的生长。PI3K/Akt/mTOR信号通路与细胞生长、增殖及分化密切相关，该通路在多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌及结肠癌的发生发展中起重要作用［3～7］。在此通路中，PTEN通过抑制PIP2向PIP3转化，进而抑制Akt1和mTOR活化，是PI3K/Akt/mTOR信号通路的负性调节因子。有研究［8.9］表明，在高浓度雌激素刺激下，PTEN 的表达和作用增强，突变率增加。2013年4～12月，我们观察了芳香化酶抑制剂来曲唑和mTOR特异性抑制剂依维莫斯对人子宫内膜癌Ishikawa细胞的体外抑制作用及其可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 Ishikawa子宫内膜癌细胞株及RPMI-1640培养基购自南京凯基公司;AnnexinV-FITC试剂盒购自上海碧云天公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品;来曲唑为连云港恒瑞制药公司产品;依维莫斯为瑞士诺华公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及干预 Ishikawa细胞于37℃、5%CO2的条件下于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液的饱和湿度培养箱内培养。收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，以3×104/mL的浓度接种于96孔培养板培养24 h后，弃原培养基后分为三组。对照组加DMSO，来曲唑组予来曲唑10－7mol/L，联合组予来曲唑及依维莫斯(浓度分别为10－7mol/L及2 μg/mL);来曲唑溶于DMSO，配成10－2mol/L母液，依维莫斯溶于DMSO，配成10 mg/mL母液，分装－20℃保存。按实验需要用RPMI-1640培养液逐级稀释成所需浓度。每组设5个复孔。

1.2.2 观察项目

1.2.2.1 细胞增殖抑制率 采用 MTT比色法。各组干预24、48、72 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于5%CO2、37 ℃培养箱中继续孵育 4 h。弃上清液，每孔加入150 μL，避光振荡10 min后选择492 nm波长，在酶标仪上测定吸光度(OD)值并绘制曲线。计算细胞抑制率。细胞抑制率=(1－用药组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 细胞凋亡率 采用 AnnexinV/PI双染法。各组干预24、48 h后消化细胞，1 200 r/min离心5 min去除培养基，PBS洗涤2次，弃上清，收集细胞。500 L Binding Buffer重悬细胞，加入 5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室温中避光孵育 30 min，1 h 内流式细胞仪检测。

1.2.4 PTEN、4E-BP1 蛋白表达 采用 Western blot法检测PTEN(人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因)、4E-BP1(真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白)。取生长分裂期Ishikawa细胞，胰酶消化后置于6孔板内，每孔约1×105个细胞，体积约5 mL，24 h细胞贴壁后移去所有上清，根据分组加入相应干预药物，每孔最终体积5 mL。于药物作用24 h后，反复冻溶后加入蛋白裂解液，收集细胞，提取蛋白，并进行蛋白定量。取15 μg蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至NC膜上，分别加入一抗PTEN(1∶1 000)、4EBP1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃摇床振荡过夜后洗涤并加入羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育30 min，Washing Buffer洗涤后，置扫描仪扫描NC膜。结果分析采用Image J分析软件系统处理，以目的蛋白条带的吸光度容积与β-actin条带吸光度容积的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。数据用±s表示，组间均数比较用单因素方差分析(One-WayANOVA)，组间两两比较用LSD或 Dunnett T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制率与凋亡率 随药物作用时间延长，来曲唑组及联合组细胞增殖抑制率逐渐升高;以作用72 h为最高。联合组各时间点细胞增殖抑制率明显高于来曲唑组。与对照组相比，来曲唑组及联合组P均＜0.05;相同时段各组之间两两相比，P均 ＜0.05;同组各时段之间两两相比，P均 ＜0.05。随药物作用时间延长，来曲唑组及联合组细胞凋亡率逐渐升高(P＜0.05);联合组各时间点凋亡率均明显高于来曲唑组(P均 ＜0.05)。见表 1。

表1 各组细胞增殖抑制率及凋亡率比较(%，±s)

表1 各组细胞增殖抑制率及凋亡率比较(%，±s)

组别 n 24 h抑制率 凋亡率48 h抑制率 凋亡率72 h抑制率对照组512.3 ±0.72 15.4 ±0.16来曲唑组 5 27.5 ±1.9 36.9 ±0.60 31.1 ±1.1 40.3 ±0.73 38.0 ±4.2联合组 5 44.3 ±2.6 52.7 ±0.81 50.9 ±1.7 59.6 ±1.03 54.7±5.1

2.2 PTEN、4E-BP1蛋白表达 用药24 h，来曲唑组及联合组PTEN表达均升高(P＜0.05)，联合组升高幅度大于来曲唑组(P＜0.05);4E-BP1表达较用药前下降(P＜0.05)，联合组下降幅度大于曲唑组(P ＜0.05)，见图 1、表 2。

3 讨论

近年来子宫内膜癌的内分泌治疗受到了广泛关注。子宫内膜增生从轻度增生、囊腺型增生、腺瘤型增生、不典型增生、原位癌、浸润癌是一连续渐进的过程［10］。目前学者们认为大多数子宫内膜癌属于雌激素依赖型，其发生、发展过程与长期雌激素刺激而无孕激素拮抗相关［1］。PI3K/Akt/mTOR信号通路与多种恶性肿瘤密切相关，在此通路中，PTEN抑制PIP2向PIP3转化，进而抑制Akt和mTOR活化，对PI3K/Akt/mTOR信号通路进行负性调节。有研究表明［9］，在增生期上皮和间质细胞中PTEN表达增高，而在分泌期腺上皮PTEN的表达有所降低。表明在高浓度雌激素刺激下，PTEN表达增强，若是PTEN发生突变缺失，失去其作用，在高雌激素的刺激下子宫内膜更易发生异常增殖。PTEN基因在子宫内膜癌中的突变率为32% ～83%，PTEN基因在子宫内膜癌机制中起着非常重要的作用［11～13］。

图1 各组干预24 h后PTEN、4E-BP1蛋白表达

表2 各组干预24 h PTEN、4E-BP1蛋白表达量比较(n=3，±s)

表2 各组干预24 h PTEN、4E-BP1蛋白表达量比较(n=3，±s)

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依维莫斯是mTOR信号通路抑制剂，通过与细胞内FKBP12蛋白形成复合物再与mTORC1结合并抑制其活性，阻止磷酸化下游的4E-BP1，影响细胞的生长和增殖。来曲唑是非甾体类芳香化酶抑制剂，能显著抑制腺体外来源的雌激素合成，阻断雌激素所致的肿瘤生长。本研究发现，应用来曲唑后Ishikawa细胞生长明显受到抑制，增殖能力下降，并呈现一定时效关系;联合组对细胞的生长抑制、诱导凋亡作用要显著优于来曲唑组，表明来曲唑与依维莫斯具有协同效应。本研究显示应用来曲唑后PTEN蛋白的表达增加，4E-BP1蛋白的表达下降，表明来曲唑可抑制细胞中PTEN基因的突变、缺失，使抑癌基因PTEN的表达增多，从而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活，致使下游的4E-BP1的表达减少，抑制肿瘤细胞增殖。依维莫斯可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，来曲唑联合依维莫斯应用，mTOR信号通路下游的4E-BP1的表达较单独应用来曲唑明显减少，表明来曲唑联合依维莫斯应用，通过抑制PTEN/PI3K/Akt/mTOR信号通路，对肿瘤细胞的抑制作用更明显。

目前化疗是晚期或复发子宫内膜癌的综合治疗措施之一，但现有化疗药物对子宫内膜癌的疗效并不显著，晚期患者预后较差［16］。因此，研究和开发新的化疗药物对于晚期或复发性子宫内膜癌患者的治疗有着重要意义。本研究结果显示，来曲唑联合依维莫斯通过调控PTEN/PI3K/Akt/mTOR信号通路，可明显抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖，促进其凋亡，为子宫内膜癌临床靶向治疗提供理论依据。

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