蜕皮甾酮对2型糖尿病大鼠肝细胞IRS-2蛋白表达的影响

朱玉霞，孙丽莎，杨 矫，陈 秋

(成都中医药大学附属医院，成都610075)

胰岛素的主要靶器官是肝脏、骨骼肌及脂肪组织，主要生理效应包括其介导的葡萄糖摄取及处理、促进蛋白质和脂肪合成、抑制糖异生、抑制脂肪分解和酮体生成等。为了探讨蜕皮甾酮对2型糖尿病大鼠肝细胞胰岛素信号转导分子基因与蛋白表达的影响，2010年3～10月，我们在前期进行的蜕皮甾酮改善大鼠胰岛素抵抗的实验基础上，应用免疫组化技术与RT-PCR方法分别检测胰岛素信号转导分子胰岛素受体底物2(IRS-2)的蛋白及mRNA表达水平，旨在探讨蜕皮甾酮胰岛素增敏的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 6周龄雄性Wistar大鼠42只，体质量130～170 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。普通饲料为我院实验动物中心配制的常规饲料，总热量为12.61 kJ/g;高脂饲料参照文献［1］喂养前1周临时配制，-20℃保存，总热量为20.53 kJ/g。葡萄糖检测试剂盒(氧化酶法，重庆医科大学临床学院检验科)，胰岛素测定试剂盒(放免法，中国原子能研究院)，免疫组化染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。PCR扩增仪(美国PE)，紫外分光光度计(日本岛津制作所)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，MUVB-20凝胶成像分析系统(美国Ultralum公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制作 14只大鼠用普通饲料喂养(正常组);28只用高脂饲料喂养1个月后，空腹状态下一次性腹腔注射STZ 25 mg/kg诱导2型糖尿病大鼠模型［1］。第7天检测空腹血糖(FPG)和胰岛素(FINS)，以 FPG≥7.0 mmol/L、胰岛素敏感性(采用钳夹试验评估)降低为成模标准。将造模成功的25只大鼠随机分为模型组13只和治疗组12只，分别给予高脂饲料喂养、高脂饲料+蜕皮甾酮灌胃治疗。

1.2.2 肝细胞IRS-2蛋白检测 大鼠喂养5周后，活体剪取肝脏左叶组织，迅速放入液氮中冷冻1 min，-80℃冻存。取冰冻肝脏组织在低温冰冻切片机上连续切片8张，厚度约5 μm，丙酮溶液中浸泡15 min，蒸馏水冲洗，晾干，-20℃保存或直接进行免疫组化试验。加入30%H2O21份+纯甲醇50份中浸泡15～20 min，蒸馏水漂洗，抗原修复，滴加正常山羊血清封闭，滴加抗IRS-2(1∶500)，4℃过夜，PBS洗涤，滴加生物素化二抗(抗兔 IgG)，37℃水浴25 min，PBS洗涤2 min×3次，滴加试剂SABC 20 min(37℃)，PBS洗涤，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。以PBS代替IRS-2抗体作为阴性对照。

1.2.3 肝细胞 IRS-2 mRNA检测 采用 RT-PCR法。引物设计:IRS-2:上游引物:5'-GGCCTCTGTGGAAAATGTCTC-3'，下游引物:5'-CTGTGGCTTCCTTCAAGTGATG-3';内参照 GAPDH:上游引物:5'-GATGCTGGTGCTGAGTATGACG-3'，下游引物:5'-GTGGTGCAGGATGCATTGCTCTGA-3'，扩增片段长度为200 bp;内参照 β-actin:上游引物:5'-CCAGAACCAACCGCGAGATGAC-3'，下 游 引 物:5'-AGGGTACATGGTGGTGCCAGAC-3'，扩增片段长度为587 bp。IRS-2 mRNA的表达量用扩增产物条带的光密度值与β-actin条带光密度值的比值来表示。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，数据以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蜕皮甾酮对大鼠肝组织IRS-2蛋白含量的影响 免疫组化结果显示，IRS-2蛋白阳性染色部位在细胞质。定量分析结果显示，正常组、治疗组、模型组的 IRS-2 蛋白含量分别为 4.90 ±0.29、3.80 ±0.30、2.43 ±0.36，正常组和治疗组显著高于模型组(t=19.70、10.29，P 均 ＜0.05)。

2.2 蜕皮甾酮对大鼠肝组织IRS-2 mRNA表达的影响 正常组、治疗组与模型组的IRS-2 mRNA表达量分别为0.52 ±0.05、0.43 ±0.03、0.27 ±0.02，正常组和治疗组显著高于模型组(t=16.78、15.84，P 均 ＜0.05)。见图1。

图1 各组大鼠肝细胞IRS-2 mRNA表达情况比较

3 讨论

正常胰岛素生理功能的发挥首先通过与靶组织细胞膜表面的胰岛素受体α亚基相结合，诱发β亚基的酪氨酸残基自身磷酸化，同时激活β亚基内在的酪氨酸蛋白激酶，进而引起胰岛素受体的多个酪氨酸残基磷酸化，后者再与含有SH2结构域的多种蛋白结合来调节细胞的生长、分化和代谢。当上述信号转导途径中任一环节发生改变，都可引起机体的胰岛素抵抗，因此胰岛素抵抗实质是胰岛素信号转导的缺陷［2］。

胰岛素抵抗可发生在胰岛素受体水平或受体后水平［3］。肝脏组织是机体利用葡萄糖的主要组织，也是2型糖尿病发生胰岛素抵抗的主要部位之一。胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生、发展中起关键作用，因此，直接针对提高胰岛素敏感性的药物近年来倍受关注。目前首推胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类(格列酮类)药物。经动物糖尿病模型及离体肝、肌、脂肪细胞株研究证实，该类药能提高肌、脂肪细胞对葡萄糖的摄取及利用，抑制肝葡萄糖输出，在2型糖尿病的治疗史上具有重要意义。前期研究已证实，蜕皮甾酮在体外有降糖作用［4］，且对IR细胞具胰岛素增敏作用［5］，但蜕皮甾酮如何促进肝细胞的葡萄糖摄取目前尚不清楚。本课题组体外实验的研究结果表明，蜕皮甾酮在一定程度上可以阻止胰岛素抵抗的形成及发展。

IRS-2是胰岛素受体的一个重要底物。正常情况下，IRS-1在胰岛素信号传递中起主要作用，但在IRS-1缺乏的动物只引起轻度胰岛素抵抗，是由于此时 IRS-2代偿了 IRS-1的作用［6］。当 IRS-1和IRS-2同时缺乏，则引起明显的胰岛素抵抗、产生严重的糖尿病，同时伴有胰岛素分泌的削弱［7］。在胰岛素代谢效应方面，促进肌肉和脂肪组织摄取、利用葡萄糖以IRS-1为主，IRS-2为次;而促进肝脏糖原合成和抑制肝脏葡萄糖输出则以IRS-2为主，IRS-1为次。IRS-2在维持糖代谢平衡［8］及IRS-2缺陷对2型糖尿病的发生发展有着比IRS-1更为重要的作用［9］。

研究证实，胰岛素信号转导通路异常可引起胰岛素抵抗。由于胰岛素刺激葡萄糖转运的信号转导途径中存在多个调控点，这些信号转导分子已成为2型糖尿病治疗的靶点［10～13］。本研究观察了蜕皮甾酮对胰岛素抵抗大鼠模型HepG2细胞胰岛素信号转导的IRS-2水平的影响，结果显示，蜕皮甾酮显著增加了肝细胞IRS-2蛋白的表达。提示蜕皮甾酮的胰岛素增敏作用可能与IRS-2蛋白的表达增强有关。

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