鱼腥草素钠联合氨苄西林对表皮葡萄球菌的抗菌作用

贾 芳，杨江流，刘文慧，邢立群

(河套学院医学系，内蒙古巴彦淖尔015000)

表皮葡萄球菌(SE)是临床常见的条件致病菌，常伴随生物材料的置入如插管、人工瓣膜、透析等医疗技术和一次性材料进入人体内，并通过黏附在生物材料表面形成细菌生物膜而使细菌产生耐药性，给临床治疗带来困难［1］。中药鱼腥草的主要抗菌成分为癸酰乙醛，向癸酰乙醛中加入亚硫酸氢钠制成的鱼腥草素钠，性质稳定又保留了抗菌活性［2］。管研等［3］报道，500 mg/L 的鱼腥草素钠对SE生物被膜的形态有显著影响，联合红霉素在亚浓度下就能有效抑制SE生物被膜的黏附和代谢。氨苄西林(AM)为广谱半合成青霉素，具有抗菌谱广、抗菌活性强、耐酸、低毒等特点，但其对β-内酰胺酶不稳定，细菌易产生耐药性。由于耐药菌的出现，单一抗菌药物已经失去疗效，因此联合用药成为控制和减少耐药菌株产生的有效手段［4］。2014年1～3月，我们观察了鱼腥草素钠联合AM对SE的体外抑制作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 8株临床分离SE菌株(巴彦淖尔市第二医院馈赠)，ATCC 29213质控菌株购买于美国菌株保藏所。鱼腥草素钠购于中国标准药品中心，溶于无菌水中配制成0.1 mol/L的药液，AM溶于磷酸缓冲液中配制成0.1 mol/L的药液，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 接种菌悬液的制备 将实验菌株划线接种于固体MH培养基过夜培养，挑去单菌落按1∶100接种于液体MH培养基中，37℃摇床过夜培养，稀释至0.5麦氏管浊度，再将该菌悬液用MH液体培养基1∶20稀释后使用。

1.2.2 药物单独抗菌活性测定 采用二倍稀释法［5］测定。在96孔细胞培养板外围孔中加200 μL蒸馏水，剩余孔均加入100 μL MH液体培养基及100 μL接种菌悬液(包括无药对照孔)。将100 μL工作浓度药液加入每排第一个孔，然后依次进行二倍稀释。同时设置10∶100和1∶100菌悬液的稀释对照，表示10%和1%细菌污染检测。鱼腥草素钠检测浓度范围为 0.78 ～100 μg/mL，AM 为 0.5 ～1 024 μg/mL。平板置于密封袋中，5%CO2、37 ℃孵育过夜。当质控菌株的MIC值处于质控范围时，以肉眼观察，药物最低浓度孔无细菌生长者，即为受试菌的MIC。MIC值测定重复3次。

1.2.3 药物联合抗菌活性测定 采用微量棋盘法［5］测定。将鱼腥草素钠与AM的MIC值两两组合，每孔抗菌药物各50 μL加入到96孔板中，试验孔及无药对照孔均加入100 μL MH液体培养基及100 μL菌悬液。联合用药各药物检测最终浓度范围同单药检测相同，MIC值判定方法相同。药物效果判定参照文献［6］方法，部分抑菌浓度指数(FICI)=(MICa联合/MICa单独)+(MICb联合/MICb单独)，FICI≤0.5 表示两者协同，0.5 ＜ FICI≤4 表示两者不相关，FICI＞4表示两者拮抗。

1.2.4 药物杀菌效力评估 从上述实验中随机抽取1株耐药菌，分别接种于含有鱼腥草素钠单药、AM单药、鱼腥草素钠联合AM的液体培养基中培养(其浓度为鱼腥草素钠和AM的MIC)，另设不加药物的空白对照孔，37℃孵育过夜，于0、12、24、36 h每孔取100 μL，用比浊管对比稀释至1×106个细菌/管，取100 μL接种于MH固体培养基，37℃孵育过夜，记录平板上的菌落数，换算成log10的形式，实验重复3次。判断标准参照文献［6］，联合用药与单独用药相比，菌落数减少≥2log10cfu/mL为协同，减少或增加＜2log10cfu/mL为不相关，增加≥2log10cfu/mL为拮抗。

1.2.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，结果以±s表示，数据的比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗SE活性测定结果 见表1。AM单独对SE的MIC为2～64 μg/mL，鱼腥草素钠单独对 SE的MIC 为12.5 ～50 μg/mL;二者联合后，AM 对 SE 的MIC降至0.5～16 μg/mL，鱼腥草素钠对 SE 的 MIC降至0.78 ～6.25 μg/mL，AM 的 MIC 下降了 4 倍，鱼腥草素钠的MIC下降了8～16倍，FICI是0.250～0.375，表明二者具有协同作用。

表1 鱼腥草素钠、AM单独和联合抗SE的MIC和FICI

2.2 杀菌效力评估结果 筛选22号和6号菌株进一步试验，如图1、2所示，不加药物的对照孔0～36 h细菌继续生长，鱼腥草素钠、AM单独作用也没有抑制细菌生长，但相同浓度下鱼腥草素钠联合AM抑制了细菌生长，药物单独作用与联合作用比较有统计学差异(P＜0.01)。联合用药与单独用药相比，菌落数的减少量明显＞2log10 cfu/mL，因此鱼腥草素钠联合AM对SE的作用具有协同效果。

图1 鱼腥草素钠 3.125 μg/mL、AM 0.5 μg/mL单独及联合作用于6号SE

图2 鱼腥草素钠 6.25 μg/mL、AM 16 μg/mL单独及联合作用于22号SE

3 讨论

中草药具有杀菌抗菌作用，且不易产生耐药性。AM为青霉素类抗生素，根据美国临床与实验室标准化研究所(CLSI)判断标准，AM单独作用8株SE的MIC为2～64 μg/mL，均为耐药菌株，AM单独作用 ATCC29213标准菌株的 MIC值为0.5 μg/mL，在质控范围内。由于抗生素的滥用导致耐药菌株的增加，寻找能抑制耐药菌株的抗生素成为近年研究的热点。Beecham制药公司首先报道了BRL42715的合成及生物活性，其对革兰阳性菌的抑菌活性较强，而对革兰阴性菌的抗菌活性弱，是目前最好的广谱内酰胺酶抑制剂，与已知的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦相比，具有更强的抑酶活性及更广的抗菌谱［7］。Synphar和Taibo公司研制合成的SYN-2190属单环β-内酰胺化合物，可特异性钝化肠杆菌、柠檬杆菌、假单孢菌和摩氏摩根菌属染色体介导的耐药菌，是C型β-内酰胺酶的有效竞争性抑制剂［8］。SE耐青霉素类抗生素的机制主要包括生物被膜和青霉素酶产生及其BPB的改变［9］。本实验选择了8株多重耐药SE分离株，观察鱼腥草素钠联合青霉素类抗生素的抗菌作用，结果显示鱼腥草素钠联合青霉素类抗生素对SE的抗菌作用明显优于单独作用。下一步我们将利用分子生物学手段探讨鱼腥草素钠是否具有抑制青霉素酶的作用，故本实验选取了AM而非耐青霉素酶的甲氧西林等抗生素类药物。

近年来，中药抑制耐药性菌株取得了较大成就。鱼腥草性味辛、寒，具有清热解毒、清肿排脓、利尿通淋之功效，临床用于治疗肿痈化脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒等。现代药理研究表明，鱼腥草素具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、利尿作用，还可增强机体免疫功能、平喘镇咳［10］，对卡他球菌、金黄色葡萄球菌、流感杆菌、肺炎球菌具有明显的抑制作用［11］。本研究显示，鱼腥草素钠单独作用8株SE 的 MIC 为12.5 ～50.0 μg/mL，与 AM 联合后，其对SE的MIC均下降，与朱玲玲等［12］的报道一致。与管研等［13］报道的鱼腥草素钠对强产膜SEATCC35984的 MIC 值0.0625 μg/mL 不一致，可能与本实验临床分离株耐药性更强有关。

本研究对AM和鱼腥草素钠进行杀菌效力评估，结果显示，相对于起始细菌数1×106/管，不加药对照组、单独AM和鱼腥草素钠细菌生长曲线向右呈上升趋势，而鱼腥草素钠与AM联合用药后细菌生长曲线向右呈下升趋势，说明联合用药与单独用药相比对细菌的杀菌效力增加。总之，鱼腥草素钠与AM具有协同抗菌作用，其作用机制可能是由于药物抑制了酶的作用，也可能是作用于其他蛋白质。

［1］Fey PD，Olson ME.Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis［J］.Future Microbiol，2010，5(6):917-933.

［2］Pan P，Wang YJ，Han L，et al.Effects of sodium houttuyfonate on expression of NF-κB and MCP-1 in membranous glomerulonephritis［J］.J Ethnopharmacol，2010，131(1):203-209.

［3］官妍，张爽，汪长中，等.鱼腥草素钠对表皮葡萄球菌生物被膜作用的研究［J］.中国药学杂志，2011，46(10):733-737.

［4］夏玲珍，丁克俭.联合用药的研究现状及发展［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10(11):204-205.

［5］Sun L，Sun S，Cheng A，et al.In vitro activities of retigeric acid B alone and in combination with azole antifungal ag ents against Candida albicans［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(4):1586-1591.

［6］Oo TZ，Cole N，Garthwaite L，et al.Evaluation of synergistic activity of bovine lactoferricin with antibiotics in corneal infection［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65(6):1243-1251.

［7］OSbome NF，Atkins RJ，Brcxan NJP，et al.Synthesis of(5R)-(Z 6，6(1-methyl1，2，3-triazol-4-ylmethy erie)penem-3-carboxylic acid，a potent bread spectrum β-lactaroase inhibitor-from 6-aminopenicillanicacid［J］.J Chem Soc Perkin Trarts，1994，179-184.

［8］沈秉正，郑珩，倪孟祥，等.B型金属β-内酰胺酶抑制剂研究进展［J］，中国新药杂志，2011，20(2):144-147.

［9］龚凤云，刘丽娜，邢铭友，等.表皮葡萄球菌耐药与生物膜的相关研究［J］.中华医院感染学杂志，2011，1(21):20-23.

［10］孟江，和殿峰，周毅生，等.鱼腥草不同提取部位药理活性的比较研究［J］.时珍国医国药，2008，19(5):1050-1051.

［11］李娟，邵慧，钟正灵，等.鱼腥草抗菌作用研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2012，17(12):1428-1432.

［12］朱玲玲，孙振新，程惠娟，等.鱼腥草素钠对头孢他啶抗铜绿假单胞菌生物被膜的增强作用及抗菌协同作用［J］.时珍国医国药，2013，24(10):2353-2355.

［13］官妍，李春，石晶金，等.亚抑菌浓度鱼腥草素钠及与红霉素联合对表皮葡萄球菌生物被膜的作用［J］.中国中药杂志，2013，38(5):731-735.