抗体库技术

惠光艳 贾文敏 石桦 周国清 颜晗 单守勤(济南军区青岛第一疗养院，266071)

·综述·

抗体库技术

惠光艳 贾文敏 石桦 周国清 颜晗 单守勤(济南军区青岛第一疗养院，266071)

由于抗体在诊断和治疗等多方面有极其重要的应用，针对各界对抗体的不同需求，目前已发展并完善起一种新的生物学技术——抗体库技术。该技术可同时有效的处理大量抗体分子，不经动物的阴性选择，从任一种属中获得少有的亲和力高、专一性强的抗体。本文将此技术作一介绍。

抗体库；体外成熟；阳性克隆

1989年，Ward等报道[1]了由重链可变区组成的单区抗体库，同年Huse等用PCR法建立了全套抗体、轻链库和全套重链Fd段基因库。他们把所有轻链片段和重链Fd(VH＋CH1)段分别克隆到λZap改造的表达载体中，构成轻重链库，然后将这两个库随机重组形成了组合抗体库。由于在V基因的5'端有分泌信号序列，所表达的Fab可分泌到细菌外。对这种λ噬菌体抗体库组合文库仍采用传统的“膜原位杂交法”筛选特异性抗体，所以对库容量为106～107筛选时其工作量之大是可想而知的。

为了克服随机组合抗体库的随机性强，库容量大，筛选工作量大和不易获得特异性抗体的缺点，1991年将噬菌体表面递呈技术引入抗体库的构建，出现了噬菌体抗体库。

来自人外周血、脾和骨髓淋巴细胞的cDNA，用PCR法扩增出抗体基因，已分泌Fab或ScFv的形式克隆到噬菌粒载体中，构建人源抗体库。

1 抗体库的构建与工程抗体的体外成熟

1.1 抗体库的构建 由于抗体的亲和力和特异性主要由抗体的可变区决定，因而对抗体进行体外成熟时，几乎都是对抗体的可变区进行突变，既可选择对整个抗体可变区进行突变，也可选择对抗体可变区的某一个或某几个小范围区域进行突变。在抗体的可变区中，与抗原结合最密切的是6个CDR，而在这6个CDR中，CDR3不仅在抗原的结合方面贡献最大，而且其与可变区其他部分(如CDR和FR等)的相互作用较其他4个CDR多，另外HCDR3的构象和长度的变化也较其他5个CDR多，因而当选择局部胞外突变时，通常选择抗体可变区的某一个或某几个CDR中(尤其是HCDR3和LCDR3)进行突变。根据突变引入的方法，可大致分为胞内突变和胞外突变。

胞内突变是利用大肠杆菌突变株mutD5实现的。菌株E.coli.mutD5的DNA聚合酶Ⅲ的ε亚单位缺陷，因而导致该3'→5'的外切功能(即教正功能)缺失，从而导致其DNA聚合酶合成DNA时的高度致错性。在用丰富培养基培养时，其致错率也较野生性DNA聚合酶提高103～105倍，即使在基本培养基中培养时，其致错率也较野生性聚合酶高10～50倍。其突变是在整个抗体可变区中随机引入，而且其突变类型主要为单碱基置换(95%)，也有少量的单碱基移码突变(5%)，但各位置的突变率与邻近序列密切相关[2]。Low等[3]利用E.coli.mutD5对抗a.phOx单链抗体进行了胞内突变，并用噬菌体呈现的方法进行了筛选，得到亲和力提高100倍的突变体。而且对突变规律进行了分析时，发现在突变率和突变类型等方面，该胞内突变系统与B细胞的超突变有惊人的相似性。

与胞内突变的方法较单一相比，胞外突变的方法显得更丰富。单选择整个抗体可变区进行突变时，一般可利用DNA重排(DNAshuffling)和致错PCR(error-pronePCR)等方法实现。DNA重排是将一组密切相关的核酸序列随机片段化，这些片段通过重组装PCR得到全长的核酸序列，在这个过程中引入突变并对不同的突变进行广泛的重组，从而完成对目的核酸序列的迅速进化，从而提高核酸序列或其蛋白的功能[4]。DNA重排一般包括3个步骤：用DNase1对目的基因随机片段化、重组装PCR和重组体的克隆和筛选，而筛选到的目的功能重组体又可作为下一轮重排的出发点。在DNA的重排过程中，由于配对的不精确性而引入突变和重组，其突变种类包括点突变、缺失、插入、颠倒、整和等自然界广泛存在的突变。其突变率可以通过控制缓冲液的组成、DNA随机片段的大小、DNA聚合酶的种类(Taq，pfu，pwo)等方法来实现，一般可控制在0.05%～0.7%之间[5]。利用DNA重排方法，Crameri等对单链抗体进行突变，筛选到表达水平和亲和力都明显提高的突变体[6]，而Proba等[7]也得到无二硫键但能够正确折叠的单链抗体突变体。

致错PCR是在标准PCR基础上对反应体系进行适当修改以增加PCR过程中的突变率。包括提高Mgcl2的浓度至7 mmol/L以稳定非配对的碱基对；加入0.5 mmol/L Mncl2以降低TaqDNA聚合酶对模板的特异性；dCTP和dTTP的浓度增加至1 mmol/L以促进错误掺入；提高聚合酶的使用量至5 U/100 μL以促进延伸链在碱基错配位置得以继续延伸。致错PCR可提高每一个核苷酸的错误率至大约7×10-3，而且这种错误率没有序列倾向性，并且所有的突变几乎都为碱基置换，插入和缺失的频率加在一起小于0.05%。利用致错PCR可在抗体的整个突变区完全随机的引入突变[8-10]。

1.2 抗体库的筛选 抗体库的筛选是从构建的抗体库中筛选出对目的抗原特异的抗体，其是抗体体外成熟的中心环节。抗体库的筛选涉及到两个方面，即抗体库的呈现和抗体库中阳性克隆的富集。

现在，已有多种抗体库的呈现手段和方法，比如，细菌表面呈现、质粒呈现、核糖体呈现等，而现今应用最为广泛的是噬菌体表面呈现技术，现就以次为例介绍抗体库的呈现[11-12]。

噬菌体表面呈现方法是Smith在1985年建立，最初是用于多肽文库的呈现。20世纪90年代初，McCafferty等[13]将该方法成功地用于抗体库的呈现。其基本原理是将抗体片段和M13噬菌体的基Ⅲ蛋白(gⅢ)的融合基因克隆在一个噬菌体表达载体上，通过辅助噬菌体的超感染，组装出在表面呈现抗体片段的重组噬菌体。

抗体库噬菌体表面呈现的关键在于抗体片段与gⅢ蛋白的融合。M13噬菌体的gⅢ蛋白在每个噬菌体上有3～5个拷贝，其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能域，该3个功能域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中N1和N2与噬菌体结合大肠杆菌的性菌毛及穿透细胞膜有关，而CT是构成噬菌体外膜蛋白结构的一部分，并将整个gⅢ蛋白的N端结构域锚定于噬菌体的一端。抗体库表面呈现系统经过十多年的发展，在抗体片段与gⅢ蛋白的融合方面出现了两种融合方式。在Phamacia公司提供的噬菌粒pCABTAB5E中，单链抗体融合在gⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间，该系统保留了完整的gⅢ蛋白，即所谓的长融合。而Krebber等人构建的用于抗体库表面呈现的噬菌粒pAK200中[14]，单链抗体C端直接与gⅢ蛋白的CT结构域相连，即实现短融合(short fusion)。在短融合时，重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整的gⅢ蛋白来提供。短融合不仅能大幅度降低噬菌体载体的长度(N1的N2结构域的编码基因长约1 000 bp)而且能够有效降低因大量表达蛋白而导致的对宿主菌的毒性和降低其对辅助噬菌体超感染的抑制效应。

呈现在噬菌体表面的抗体库的富集方法有固相富集和液相富集两种方法。抗体库的固相富集十时毫利用包被在固相载体(如酶联板、组织培养瓶或免疫管等)上的抗原结合呈现在噬菌体表面功能抗体而实现的。而液相富集是首先利用生物素标记的抗原(biotinylated-Ag)在液相中结合表面呈现功能抗体的重组噬菌体一，然后利用亲和素偶联的琼脂糖(steptavidin-agrose)或亲和素偶联的滋珠来捕获与biotinylated-Ag结合的重组噬菌体，从而实现对抗体库中功能抗体的富集。这两种富集方法各有其特点：固相富集方法是最经典的富集方法，其结合-洗脱等每个环节都有比较成熟的实验参数可以参考，具有良好的重复性。而液相富集有利于保持抗原的天然构象，而且能够精确控制富集时抗原的浓度，从而能够以低浓度抗原筛选到高亲和力的抗体。但在实际工作中要考虑周到，抗原的生物素标记可能会影响抗原上的抗体结合表位从而可能破坏抗体-抗原的结合，而且大分子抗原的生物素标记效果往往较差。另外液相富集时经常出现较高的筛选背景，因此需要对富集过程的洗涤条件进行优化和严格的控制以尽量降低富集过程中的背景以提高富集效果。

为了进一步降低对噬菌体表面呈现的抗体库进行筛选时的背景，Krebber等[15]在噬菌体表面呈现技术的基础上，发展了选择性感染噬菌体技术(selective infective phage SIP)。该方法的基本原理是基于短融合的噬菌体表面呈现系统。但在SIP系统中所使用的辅助噬菌体不能提供完整的gⅢ蛋白，其制备的重组噬菌体表面呈现抗体但缺乏完整的gⅢ蛋白，因而这些重组噬菌体自身并不能感染大肠杆菌。而SIP系统的另一个特点是筛选用的目的抗原必须与制备的gⅢ蛋白的N1-N2结构域进行体外的化学交联(Ag-N1-N2)。只有那些在表面呈现功能抗体的噬菌体才能通过抗原-抗体作用而恢复其感染性而得到扩增。因而SIP技术能够大大降低噬菌体呈现系统的筛选背景，提高了筛选效率。

在对噬菌体表面呈现的抗体库进行筛选时常用到的另一个方法是去筛选(deselection)，该方法在筛选高特异性抗体时被广泛使用。去筛选是先在制备的重组噬菌体溶液中加入具有交叉反应的抗体进行封闭，随后再用目的抗原对封闭后的抗体库进行富集，从而极大地提高了从抗体库中筛选出高特异性抗体的效率。Parsons等[16]利用该方法对一株与HbA(adult haemoglobin)有交叉反应的抗HbF抗体进行了体外成熟，得到特异性明显提高的抗HbF(foetal haemoglobin)抗体。而且Hemminki等[17]利用去筛选方法也得到了特异性明显改善的抗睾丸激素抗体。本实验室在对抗人纤维蛋白单链抗体进行体外成熟时，利用去筛选策略筛选到特异性提高的单链抗体。

1.3 阳性克隆的鉴定 阳性克隆的鉴定是抗体体外成熟的最后一个环节，其目的是从经多轮富集后的抗体库中鉴定出生物特性明显改善的单克隆。阳性克隆的鉴定方法是与抗体库的筛选方法密切相关的。

当抗体库用噬菌体表面呈现方法进行筛选时，则既可以用噬菌体ELASA方法对大量单克隆进行定性鉴定，也可以用分泌的可溶性抗体进行常规ELASA鉴定，Griep等[18]在1999年建立了一种新的阳性克隆鉴定方法，即将经多轮富集所得的单链抗体的混合基因克隆到碱性磷酸酶系统，从而构建出单链抗体-碱性磷酸酶融合表达单元，经进一步ELASA就可实现对单克隆的鉴定，该方法避免了使用任何酶标二抗，不仅简便、经济，而且有效的降低了假阳性比例。

阳性克隆的进一步细致的定量分析则需要首先对选出的阳性克隆进行优化并对表达的抗体进行纯化。最直接的定量分析方法是利用Pharmacia公司的BLAcore设备测定抗体的Kd值[19]。另外，Mackenzie等[20]建立的环磷酰胺洗脱法可方便地比较针对同一抗原的不同抗体的相对亲和力，因而特别适合于比较来自同一抗体库的不同克隆的相对亲和力。

2 抗体库的应用与展望

2.1 在肿瘤诊断与治疗方面的应用 利用肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原筛选体，用于肿瘤的诊断，免疫成像定位，并有助于对肿瘤标志物的研究。肿瘤特异性抗体可选择性识别和杀伤肿瘤细胞，由抗体结合区与病毒和化疗药物相融合而制成“导向药物”，能有效的特异性摧毁肿瘤。

最近，Goodson等[21]用肽库筛选出与尿激酶结合的配体，据说人肿瘤细胞的侵入概率与结合受体的尿激酶正相关。

2.2 药物设计中的应用 传统药物的发现过程是对活细胞和动物模型进行筛选，费时、费功，而某些疾病由于没有适当的动物模型，而限制了对其治疗药物的发现。肽库和抗体库的出现，可用于医学上感兴趣的受体筛选出相应的配体，利用受体和配体结合的结构信息，结合其他的技术用于药物设计和生产。例如，在目前条件下研究具有较大毒性细菌脂多糖的结构是很困难的，甚至是不可能的，利用抗体库制备出来的抗体完全可以模仿其生物活性构型。由于抗体片段是由多肽构成的，在体内不稳定，不能直接用做药物进行治疗，但可以利用较稳定的与其构型相同或相似的芳香族化合物来替之，用做药物的生产和临床治疗。目前，在脑卒中(stroke)病人的治疗中，有研究已证实运用抗粘附分子抗体来阻断粘附分子，可减轻脑组织的损害[22]。此外，对于多灶性运动神经病(multifocal motor neuropathy，MMN)的治疗临床多采用环磷酰胺及人免疫球蛋白，应用人抗体治疗MMN患者后常可见到症状性改善，但有效期长短各异。因此，抗体用于临床治疗这一领域预计会有很大的突破。

2.3 植被表达系统中的应用 在植物体内可以表达完整有活性的抗体分子且能糖基化，通过有性杂交途径可以遗传给后代，这样可以大大的降低抗体生产成本。也许有一天，人们只要直接食用植物，就可以预防和治疗某些疾病。

目前，人们在某些植物病害(特别是真菌病害和某些病毒病)面前束手无策，要减轻和预防这些病害的危害，每年要花费大量的人力物力，使用超量的农药。

抗体库技术作为抗体研究的一个前沿领域，各方面正在日趋成熟和完善，而且正在出现一些新的方法和新技术。随着抗体库技术的不断发展和应用，抗体的获取工作将会更方便、更富有成效。这使得提高各种人源化抗体和小分子抗体片段的亲和力和特异性成为可能，为抗体的发展开创了更广阔的前景。

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It has been proved that antibodies are extremely important in the medical diagnosis and treatment.To meet the diverse demands of antibodies in different fields，a new biotechnology known as antibody library has been developed and improved.This biotechnology can simultaneously deal with a large number of antibodies in an efficient way，and then obtain rare antibodies with high specificity and affinity from any species without negative selection of animals.This review is focused on the constructions，applications and prospects of this biotechnology.

Antibody library；In vitro maturation；Positive clone

2014-08-19)

全军医学科研“十二五”课题计划重点项目(BWS11J003)

1005-619X(2014)11-0969-03

10.13517/j.cnki.ccm.2014.11.004