鸡枞菌精多糖对酒精性损伤小鼠肾及免疫器官的抗氧化作用

邢 佳，陶明煊,*，郭宇星，程光宇，赵云霞，蒋文亭，张梦宇，杜伟佳

鸡枞菌精多糖对酒精性损伤小鼠肾及免疫器官的抗氧化作用

邢 佳1，陶明煊1,*，郭宇星1，程光宇2，赵云霞1，蒋文亭1，张梦宇1，杜伟佳1

（1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046）

目的：研究鸡枞菌精多糖（refined polysaccharide from Termitomyces albuminosus，RTAP）对酒精所致急性肝损伤小鼠肾、脾脏及胸腺的保护作用。方法：采用超声波辅助的热水浸提法提取鸡枞菌多糖，小鼠被随机分为正常组、模型组、阳性对照组（饲喂联苯双酯，150 mg/（kg·d））、RTAP各剂量组（100、200、400 mg/（kg·d）），连续灌胃30 d，正常组按等量生理盐水灌胃。第31天除了正常组外，给予50%乙醇（12 mL/kg）建立动物急性肝损伤模型。小鼠处死后取肾脏、脾脏、胸腺，测定各项抗氧化指标。结果：与模型组相比，RTAP各剂量组均能降低肾脏、脾脏及胸腺丙二醛含量，提高各器官超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性及谷胱甘肽含量。结论：RTAP对酒精性损伤小鼠肾及免疫器官具有明显的抗氧化作用，其原理应该与其所具有抗脂质过氧化和清除体内过多的氧自由基作用有关。

鸡枞菌多糖；抗氧化；酒精性损伤；肾；免疫器官

过量饮酒会导致许多脏器损害，如肝脏、肾脏、脾脏等，乙醇经CYP2E1系统可生成大量的活性氧基团（reactive oxygen species，ROs），引发脂质过氧化（lipid peroxide，LPO）[1]。肝脏是酒精代谢的主要器官，也是最容易受损的器官。而肾脏是乙醇重要的排泄器官，人体摄入5%～10%的酒精是通过肾脏氧化与排泄的，酒精等水溶性外源物质在肾脏细胞和间质内积聚、浓缩，对肾脏会造成一定程度的损害[2]。此外还有研究表明，饮酒过量对哺乳动物脾脏和胸腺的生长发育具有显著的抑制作用，引起脾脏细胞发生脂质过氧化，细胞膜通透性增强，膜表面受体受损，进而影响机体的免疫功能[3-4]。

鸡枞菌，是珍贵的食用菌，又名蚁枞、鸡脚麟菇，属担子菌纲，伞菌科。它不但味道鲜美，营养丰富，而且还能延缓衰老，提高机体抗病毒能力，有报道称这可能是由于其中含有大量多糖物质的原因[5]，而多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂和增强机体免疫力的作用[6]。本实验以鸡枞菌为原材料，探讨鸡枞菌精多糖（refined polysaccharide from Termitomyces albuminosus，RTAP）对酒精性损伤小鼠肾及免疫器官的保护作用，旨在为保健食品或天然药物的研制和开发提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡枞菌（Termitomyces albuminosus）子实体干品购自云南丽江市古城区喜玛拉雅贸易有限责任公司，经去杂质，剪去含培养基的根部，于60 ℃低温烘干后粉碎加工成60 目细粉。将细粉经超声波辅助水提、浓缩、4 倍体积乙醇沉淀、低温干燥等步骤后，得到粗多糖，粗多糖经Sevag法脱蛋白、透析、乙醇沉淀、低温干燥后得到RTAP，经测定多糖含量为68.15%，蛋白质含量为1.33%。

1.2 动物

扬州种雄性6 周龄小鼠，体质量（19.01±0.817） g，动物试验在江苏省中医院动物饲养中心进行，动物饲养许可证号（SYXK（苏）2012-0047）。

1.3 试剂与仪器

四乙氧基丙烷 Fluka公司；NBT、DTNB 南京卓尔生化有限公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、谷胱甘肽（L-glutathione，GSH） 美国Sigma公司；无水乙醇、H2O2、硫代巴比妥酸（thiobarbituricacid，TBA）等生化试剂均为国产分析纯。

JY92-Ⅱ超声波细胞破碎器 宁波新芝生物科技股份有限公司；GL-22M高速冷冻离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；722可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酒精诱导肝损伤动物模型的建立

小鼠适应性喂养3 d，随机分为正常组、模型组、阳性对照组（饲喂联苯双酯150 mg/（kg·d））、RTAP各剂量组（100、200、400 mg/（kg·d）），每组11 只。受试样品用蒸馏水配制，每天灌胃受试样品1 次，连续灌胃30 d，实验期间供给全价颗粒饲料，不限制饮食饮水。实验至第31天，各组小鼠禁食不禁水12 h后，阳性对照组、RTAP各剂量组及模型组以12 mL/kg（以体质量计）的量，用50%乙醇溶液灌胃，建立小鼠急性肝损伤模型，正常组灌予等体积的蒸馏水。去除死亡小鼠，每组10 只，均在灌胃12 h后，脱臼处死小鼠，取肾脏、脾脏及胸腺测定各抗氧化损伤指标。

1.4.2 肾脏、脾脏及胸腺匀浆的制备

准确称取0.1 g肾脏，用生理盐水洗去污血后拭干，剪碎并加入0.9 mL预冷的50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.8），于冰水浴中进行超声破碎（400 W，20 s×3）制成10%肾匀浆。肾匀浆于4 ℃条件下10 000 r/min离心10 min，一部分上清液用于测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，另一部分上清液以3∶1的比例加饱和硫酸铵溶液，同样条件下离心上清液即为粗酶液，用于测定超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性。脾脏及胸腺匀浆以同样的方法制备。

1.4.3 指标测定

过氧化脂质降解产物MDA含量：采用TBA法[7]测定；GSH含量：按文献[8]方法测定；GSH-Px活性：采用DTNB法测定[9]；SOD活性：按Stewert等[10]的NBT光化还原法测定；CAT活性：采用紫外分光光度法[11]测定。

1.5 数据分析

实验数据用DPS13.5统计软件进行统计学分析，单因素方差分析，数据用±s表示。

2 结果与分析

2.1 RTAP对酒精损伤后小鼠肾及免疫器官中的MDA含量影响

表1 RTAP对小鼠肾及免疫器官MDA含量影响（x±s，n=10）Table 1 Effect of RTAP on MDA contents in kidney and immune organs of mice（x±s,, n=10）

由表1可知，经造模后，小鼠各器官模型组MDA水平均明显高于正常组，呈显著性差异（P＜0.05）。给予RTAP后，多糖各剂量组MDA水平均有显著性降低，呈一定的量效关系。多糖高剂量组肾的MDA含量不仅与正常组含量相当甚至好于药物组。说明RTAP能有效改善小鼠肾损伤及免疫器官中的脂质过氧化水平。

2.2 RTAP对酒精损伤后小鼠肾及免疫器官中的GSH含量影响

表2 RTAP对小鼠肾及免疫器官GSH含量影响（x±s，n=10）Table 2 Effect of RTAP on GSH contents in kidney and immune organs of mice（x± s,, n=10）

由表2可见，经造模后，肾、脾脏和胸腺中GSH的含量均低于正常组，表明酒精会造成肾、脾脏及胸腺中GSH含量的降低，给予RTAP后，各剂量组的GSH含量都明显比模型组高。其中高剂量组脾GSH含量已与正常组水平相当；高剂量组胸腺GSH含量已超过阳性对照组；高剂量组肾GSH含量未达到阳性对照组水平，但随着多糖剂量的增加，可明显提高肾匀浆中的GSH含量。说明RTAP能显著提高小鼠肾及免疫器官中GSH含量，增强机体的抗氧化能力，减轻酒精对小鼠肾及免疫器官的损害作用。

2.3 RTAP对酒精损伤后小鼠肾及免疫器官中的GSH-Px活性影响

表3 RTAP对小鼠肾及免疫器官GSH-Px活性影响（x±s，n=10）Table 3 Effect of RTAP on GSH-Px activities in kidney and immune organs of mice（x±s,, n=10）

由表3可见，经造模后，肾、脾脏和胸腺中GSH-Px的活性均低于正常组，呈显著性差异（P＜0.05）。给予RTAP后，各剂量组GSH-Px活性均比模型组高，其中高剂量组脾脏GSH-Px含量甚至比模型组提高了346.48%；高剂量组胸腺GSH-Px活性已超过阳性对照组，且具有显著性（P＜0.05）；高剂量组肾GSH-Px活性虽未达到阳性对照组水平，但随着多糖剂量的增加，可明显提高肾匀浆中的GSH-Px活性。从各脏器中GSH-Px活性的变化可以看出，RTAP对酒精性损伤小鼠肾与免疫器官有一定抗氧化作用。2.4 RTAP对酒精损伤后小鼠肾及免疫器官中的SOD活性影响

表4 RTAP对小鼠肾及免疫器官SOD活性影响（x±s，n=10）Table 4 Effect of RTAP on SOD activities in kidney and immune organs of mice（x±s,, n=10）

由表4可见，经造模后，肾、脾脏和胸腺中SOD活性均低于正常组，呈显著性差异（P＜0.05）。给予RTAP后，各剂量组SOD活性均比模型组高，且随着多糖剂量组的增加SOD活性也提高，呈一定的量效关系。其中高剂量组肾、脾脏中SOD活性已超过阳性对照组；高剂量组胸腺SOD活性虽未达到阳性对照组水平，但随着多糖剂量的增加，可明显提高胸腺匀浆中的SOD活性。说明RTAP能提高肾及免疫器官内SOD活性，减少了酒精对其损伤。

2.5 RTAP对酒精损伤后小鼠肾及免疫器官中的CAT活性影响

表5 RTAP对小鼠肾及免疫器官CAT活性影响（x±s，n=10）Table 5 Effect of RTAP on CAT activities in kidney and immune organs of mice（x±s，n=10）

由表5可知，经造模后小鼠肾、脾脏和胸腺CAT活性显著低于正常组（P＜0.05）。给予RTAP后，多糖各剂量组CAT活性均呈量效关系增加，高剂量组肾、脾脏和胸腺CAT活性与模型组相比分别提高了58.86%、128.28%、103.78%，其中胸腺的CAT活性甚至超过了阳性对照组水平。说明RTAP可改善因饮酒而导致的脏器细胞的衰老程度。

3 讨 论

临床实验已经证实：饮酒过量会导致肾小管上皮细胞损伤、发生炎症反应等，产生的细胞因子将作用于肾间质，促进细胞外基质的积聚[2]，引起间质纤维化[12-13]，使小鼠肾脏内促氧化物质增多和抗氧化物质减少，促生氧化应激反应，最终导致肾细胞坏死或凋亡。此外，在免疫方面，酒精还可降低胸腺和脾脏[14]或其两者的淋巴细胞生成量和释放率及淋巴细胞亚群的相对含量，降低免疫力。

MDA、GSH、GSH-Px、SOD、CAT水平是衡量脏器抗氧化程度的重要指标[15-19]。本实验以鸡枞菌为原材料，通过建立急性酒精肝损伤模型，探讨了RTAP对氧化损伤小鼠的抗氧化作用主要是提高组织的抗氧化酶和降低MDA含量来实现的。结果表明，造模后小鼠肾脏、脾脏及胸腺GSH含量减少，SOD、GSH-Px和CAT活性下降，脂质过氧化终产物MDA含量增加，与正常组对比，均达到了显著性差异，与急性酒精性损伤机理研究结果相符。而喂饲各剂量RTAP的小鼠肾脏和免疫器官的GSH-Px、SOD、CAT活性均得到了较明显的改善，GSH含量逐渐增加，MDA含量也明显降低，这可能是通过RTAP预处理提高内源性抗氧化防御体系实现的。说明RTAP对受损小鼠脏器组织有较好的抗氧化作用。

细胞氧化损伤的途径有很多，不同的途径都会加速机体的衰老，因此从天然的食品中寻找高效安全的自由基清除剂，已迫在眉睫。越来越多的研究发现[20-23]，许多食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物膜，延缓衰老和提高机体免疫的作用，而鸡枞菌多糖不仅具有抗氧化作用，还对T细胞免疫功能具有明显的增强作用[6,24]，这也与本结果相符。从食用菌中提取天然抗氧化物质是当前保健食品开发研究的发展方向之一，随着研究的不断深入，RTAP在生物抗氧化方面将有更广阔应用前景。

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Antioxidant Effect of Polysaccharide from Termitomyces albuminosus on Kidney and Immune Organs in Mice with Alcoholic Hepatic Injury

XING Jia1, TAO Ming-xuan1,*, GUO Yu-xing1, CHENG Guang-yu2, ZHAO Yun-xia1, JIANG Wen-ting1, ZHANG Meng-yu1, DU Wei-jia1
(1. College of Ginling, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)

Objective: The protective effect of a refined polysaccharide fraction from Termitomyces albuminosus (RTAP) on kidney, spleen and thymus in mice with acute alcoholic hepatic injury was investigated. Methods: The refined polysaccharide from Termitomyces albuminosus was extracted by ultrasound-assisted hot water. Mice were randomly divided into blank control group, alcoholic injury model group, positive control group (administered with 150 mg/(kg·d) bifendate by gavage) and RTAP groups at doses of 100, 200 and 400 mg/(kg·d). All mice were administered for 30 days prior to administration of 50% alcohol 12 mL/(kg·d) except that the blank control group was given an identical volume of saline. After alcohol treatment, all mice were sacrificed through cervical dislocation and subjected to analysis of antioxidant capabilities in the kidney, spleen and thymus. Results: Compared with the model control group, the contents of MDA in kidney, spleen and thymus were obviously decreased, while the contents of GSH and activities of SOD, CAT and GSH-Px were obviously increased in the RTAP treatment groups. Conclusion: RTAP has antioxidant effect on kidney and immune organs in mice with alcoholic hepatic injury, and the mechanisms might be associated with its antioxidant activity.

Termitomyces albuminosus polysaccharide; antioxidant; alcohol injury; kidney; immune organs

TS201.4

A

1002-6630（2014）09-0246-04

10.7506/spkx1002-6630-201409048

2013-06-14

国家自然科学基金青年科学基金项目（31101314）；江苏省自然科学基金项目（BK2011787）；江苏省高校自然科学基础研究项目（13KJB550013）

邢佳（1989—），女，硕士研究生，研究方向为生物活性物质与保健功能因子。E-mail：Christina_320@yeah.net

*通信作者：陶明煊（1970—），男，副教授，硕士，研究方向为生物活性物质与保健功能因子。E-mail：45017@njnu.edu.cn