致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸组成及营养评价

拓 云，霍彩琴，田福东，申丽威，宋 波，蓝 岚，魏晓双，国博闻，李文滨，刘珊珊,*

致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸组成及营养评价

拓 云1，霍彩琴2，田福东3，申丽威1，宋 波1，蓝 岚1，魏晓双1，国博闻1，李文滨1，刘珊珊1,*

（1. 东北农业大学 大豆生物学教育部重点实验室，农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江禾田丰泽兴农科技开发有限公司，黑龙江 哈尔滨 150000；3.内蒙古通辽市农业科学研究院，内蒙古 通辽 028015）

结合模糊识别方法评价的数学模型法和联合国粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organiz ation/ World Health Organization，FAO/WHO）、鸡蛋蛋白两种模式下的化学分析法评价两个致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白质氨基酸营养价值，解析α亚基缺失特性对大豆氨基酸组分及营养品质的影响。用氨基酸分析仪测定氨基酸的组分和含量，α亚基缺失特性用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）确认，蛋白和脂肪含量用Perten 8620近红外谷物分析仪测定。结果表明：1）致敏蛋白α亚基缺失型大豆的氨基酸总量、必需氨基酸总量、蛋白质、油分含量不因α亚基的缺失而降低；2）致敏蛋白α亚基缺失型大豆的11S/7S比值在4.65以上，高于目前普遍报道的2.0～3.0；3）致敏蛋白α亚基缺失型大豆必需氨基酸含量接近或高于FAO/WHO标准；两种模式下，α亚基缺失型大豆的5种化学评分及贴进度值都很高，接近标准蛋白。致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白质氨基酸组分平衡，11S/7S比值更优，营养品质更高。

大豆；α亚基缺失；氨基酸；营养评价

大豆蛋白质主要由7S和11S球蛋白组成，7S球蛋白是由α’（76 kD）、α（72 kD）、β（52～54 kD）3 个亚基组成的分子质量为150 kD的三聚体[1-4]。大豆种子中7S和11S球蛋白含量相当，二者为负相关；与11S球蛋白相比，7S球蛋白的含硫氨基酸含量及氨基酸总量低，营养品质差[5]，7S球蛋白的减少可导致11S球蛋白的补偿性增加[6-7]，从而提高大豆蛋白的营养品质[7]。7S球蛋白功能特性也不及11S球蛋白，降低7S球蛋白的含量可以改善大豆蛋白的加工品质[8]。研究表明，α亚基是大豆主要的致敏原之一[2,9]。目前工业上清除大豆致敏蛋白的物理[10]、化学[11]、降解[12-14]等方法存在清除不彻底，化学物质残留、加工成本高，酶特异性不强的弊端，无法获得零抗原大豆产品。目前，为了彻底减少或除去致敏蛋白，改良大豆营养与加工品质，育种家们已经培育出了一系列能够正常播种、生长和收获的7S球蛋白亚基缺失大豆品种[5,7,15-16]。

蛋白质营养价值的高低由必需氨基酸组分的种类、数量及各组分所占的比例决定。目前，蛋白质营养价值评价方法，主要有联合国粮农组织和世界卫生组织提出的蛋白质营养价值评价的必需氨基酸模式，氨基酸比值系数法及其衍生方法、不同模式的化学分析法、生物评价法和模糊识别方法评价的数学模型法。这些方法已成功应用于家禽肉[17]、罗非鱼饲料原料[18]、小米[19-20]、麦冬[21]、水果[22-23]等蛋白质氨基酸的营养评价，为人类合理利用这些蛋白质资源提供了理论依据。本实验用2012年获得的2 个致敏蛋白α亚基缺失型大豆新品系，进行氨基酸测定和大豆蛋白质必需氨基酸营养价值评价，为致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白的科学合理利用、营养价值的提高及大豆亚基缺失突变体育种提供科学依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东农47为黑龙江省高油大豆品种、亚基表现为正常型；日B亚基表现为（α’＋α）-亚基缺失型；Cb15和Cb80为东农47和日B通过杂交-回交方式获得，选育过程如图1所示。2008年夏季配制杂交组合，F1代于当年冬季南繁加代得到F2代，F2代种子经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，筛选出α-亚基缺失型种子于2009年春季播种，用于回交。同样的南繁加代及SDS-PAGE法筛选α-亚基缺失纯合型种子用于每一轮回交的α-亚基缺失特性的供体亲本。每一代都进行亚基缺失检测，于2012年秋季获得了两个致敏蛋白α亚基缺失型大豆新品系Cb15和Cb80。

图1 致敏蛋白α亚基缺失型大豆新品系选育过程Fig.1 Procedures for the breeding of α-subunit deficient soybean lines

Tris-HCl、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝、甘氨酸、SDS、TEMED、丙烯酰胺，尿素、双丙烯酰胺、过硫酸铵。

1.2 仪器与设备

Perten 8620近红外谷物分析仪 美国福斯公司；日立L-8800氨基酸分析仪 日本日立公司；Mini-型蛋白质电泳系统 美国Bio-Rad公司；PowerLook 2100 XL扫描仪 台湾UMAX公司。

1.3 方法

1.3.1 SDS-PAGE梯度电泳分析及大豆球蛋白亚基含量测定

α亚基缺失的检测参照刘珊珊等[15-16,24-25]报道过的方法，略有改进：称取5 mg大豆粉，加0.5 mL抽提缓冲液（0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.2% SDS，5 mol/L尿素）充分混匀，静置过夜（室温），再加10 μL巯基乙醇，充分混匀，4 ℃，18 000×g离心15 min，取8～13 μL上清液（0.75 mm玻璃板点样8 μL；1.0 mm玻璃板点样13 μL）进行11.98%分离胶、4.38%浓缩胶的SDS-PAGE电泳（电泳条件15 mA/胶，20 min；30 mA/胶，70 min）及考马斯亮蓝染色直接用微波炉加热水煮2～3 次，8 min/次，之后用PowerLook 2100 XL扫描仪扫描-SDSPAGE凝胶并保存图片。

大豆球蛋白各亚基相对含量定义为其光密度占该泳道总光密度的百分率。亚基含量测定采用美国Bio-Rad公司Quangtity One 4.6.2版本获得原始数据，利用Excel2003对原始数据进行分析得到实验结果。

1.3.2 品质分析

利用Perten 8620近红外谷物分析仪测定蛋白质、脂肪含量；氨基酸含量按照国家标准GB/T 18246—2000《饲料中氨基酸的测定》方法，利用日立L-8800氨基酸分析仪测定：大豆样品0.100 g、6 mol/L HCl 10 mL加入安瓿瓶，混匀后封口，于110 ℃烘箱内水解24 h，冷却后定容至50 mL，用0.45 μm水相滤头过滤200 μL溶液于大口离心管中，再于60 ℃烘箱内浓缩尽液体后，加入1 mL 0.02 mol/L HCl混匀，制得样品溶液上机测定。

1.3.3 氨基酸营养价值评价

氨基酸营养价值根据联合国粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）氨基酸评分标准模式和鸡蛋模式进行营养价值评定；化学分析法的氨基酸评分（amino acid score，AAS）、化学评分（chemical score，CS）、必需氨基酸指数（essential amino acid index，EAAI）、氨基酸比值系数分（score of ratio coeffieient of aoino acid，SRCAA）和必需氨基酸相对比值（essential amino acid relative ratio，EAARR）根据钱爱萍等[18]的方法计算；模糊识别法评价根据钱爱萍[17]、颜孙安[20]等的方法计算。用Excel分析原始数据，得到实验结果。

2 结果与分析

2.1 致敏蛋白α亚基缺失型大豆主要品质特性分析

表1 致敏蛋白α亚基缺失型大豆品质特征分析Table 1 Quality characteristic analysis of soybean seeds with α subunit deficiency

由表1可知，伴随日B的α亚基缺失特性的导入，Cb15和Cb80的蛋白质、脂肪含量较东农47提高到43.8%、44.9%；脂肪含量降低为21.7%、20.4%；蛋白质和脂肪总含量比两亲本都高，分别为65.5%、65.3%。根据脂肪含量大于20%，同时蛋白质和脂肪总含量高于63%为“双高（高油、高蛋白）”品种的标准，这两个品种均属于“双高”型品系。

2.2 致敏蛋白α亚基缺失型大豆球蛋白亚基分析

图2 致敏蛋白α亚基缺失型大豆SDS-PAGE图谱分析Fig.2 SDS-PAGE profile analysis of soybean seeds with α subunit deficiency

α亚基缺失特性经2 次回交，4 次自交导入中国高油大豆品种东农47，获得Cb15与Cb80两个优良品系，两品系7S球蛋白亚基组成如图2所示。α亚基缺失特性稳定遗传，各亚基条带清楚，分辨效果较好。Cb15和Cb80的7S球蛋白均由α’和β两个亚基组成，11S球蛋白由A3、A1A2A4、B3、B1B2、B4和A56 个亚基组成，各亚基含量测定结果见表2。

表2 致敏蛋白α亚基缺失型大豆球蛋白亚基相对含量分析Table 2 Subunit contents of soybean storage protein in soybean seeds with α subunit deficiency %

由表2可知，伴随α亚基缺失性状的导入，Cb15和Cb80的7S球蛋白和11S球蛋白组分的相对含量均发生了变化。Cb15和Cb80的7S球蛋白相对含量分别为13.54%、13.16%，与轮回亲本东农47相比分别降低了6.15%和6.53%，；7S组分的α’亚基相对含量提高，分别为6.87%和5.67%；β亚基相对含量降低，分别为6.67%和7.48%。11S球蛋白组分亚基相对含量的变化，主要体现在A1A2A4、B3、B1B2、A54 个亚基上，其中A1A2A4和A5亚基相对含量变化最明显。与东农47相比，以上两株系的A1A2A4亚基大幅降低，由17.13%降低至11.62%和7.90%；A5亚基增幅较大，分别为12.31%和11.50%。Cb15的11S球蛋白相对含量总量与东农47接近，而Cb80降低为61.21%。姜振峰[26-27]、简爽[28]、蒋涛[29]、刘春[30]等的研究表明，大豆7 S球蛋白相对含量总量均值范围为23.54%～29.96%，11S球蛋白为57.51%～69.80%。本实验获得的致敏蛋白α亚基缺失型株系Cb15和Cb80的11 S球蛋白相对含量范围与上述研究一致，但7 S球蛋白相对含量明显偏低。另外，Cb15和Cb80株系的11S＋7S相对含量总量稍低于东农47，但11S/7S比值分别为4.93和4.65，远大于东农47的（比值为3.38），更高于上述研究报道的2.0～3.0。

2.3 致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸组成分析

表3 致敏蛋白α亚基缺失型种子氨基酸组成分析Table 3 Amino acid analysis of soybean seeds with α subunit deficiency %

由表3可知，Cb15和Cb80二者氨基酸组分齐全，与东农47和日B一致，含有包括苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸等9 种必需氨基酸（半必需氨基酸）在内的17 种氨基酸，此结果与前人研究结果相符[15,31]。Cb15和Cb80的17 种氨基酸组分当中，含量居前两位的由高到低依次是：谷氨酸＞天冬氨酸；含硫氨基酸蛋氨酸（0.58%、0.62%）、胱氨酸（0.76%、0.77%）含量最低；Cb15除蛋氨酸、胱氨酸，Cb80除丝氨酸、胱氨酸、酪氨酸外，二者其余氨基酸组分含量均高于东农47；二者氨基酸总量和必需氨基酸总量都比东农47和日B高，氨基酸总量分别为41.94%、41.07%，较东农47提高了3.05%和2.18%；必需氨基酸总量分别为14.47%、14.61%，较东农47增加了0.58%和0.92%。该结果表明，致敏蛋白α亚基缺失型大豆的氨基酸组分没有改变，氨基酸总量和必需氨基酸总量未降低，与Takahashi等[32]的研究结果相似。

2.4 致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白营养价值评价

根据现代营养学的观点，食物蛋白质的氨基酸组成越接近人体蛋白的组成，并为人体消化吸收时，该食物的营养价值才越高[33]。上述数据和结果尚不能全面反应致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸组分与人体蛋白组分的差异以及其所含必需氨基酸组分是否平衡，营养价值高低体现不明显，有待氨基酸营养价值评价分析。由于组氨酸是婴幼儿、尿毒症患者、幼龄动物的必需氨基酸，而大豆又是婴幼儿奶粉、动物饲料的重要添加原料，因此将其参数也列为以下评价中。

2.4.1 FAO/WHO模式和全蛋模式对致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸的评价结果

表4 致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸含量与FAO/WHO模式和全蛋模式的比较Table 4 Comparison of amino acids between soybeans without α-subunit with the FAO/WHO and the whole egg reference patterns mg/g pro

由表4可知，全蛋模式必需氨基酸各组分含量标准比FAO/WHO标准高。致敏蛋白α亚基缺失型大豆Cb15、Cb80的必需氨基酸含量较平衡：苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸＋胱氨酸含量低于FAO/WHO模式标准；其余必需氨基酸含量都高于FAO/WHO标准；氨基酸总值都大于FAO/WHO的367.00 mg/g pro标准，分别为406.62、394.88 mg/g pro。此外，Cb15的各必需氨基酸组分含量及氨基酸总量都高于日B（苏氨酸除外），但与东农47接近。

2.4.2 FAO/WHO模式和全蛋白模式下5种化学分析方法的营养评价

表5 两种参考模式下致敏蛋白α亚基缺失型大豆的AASS、CCSS、EAAI、SRCAA、EAARRTable 5 AAS, CS, EAAI, SRCAA and EAARR of soybeans without α-subunit in the FAO/WHO and the whole egg reference patterns

致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸在FAO/WHO、鸡蛋蛋白质两种氨基酸标准模式下的5种化学评价方法测定结果见表5。FAO/WHO和鸡蛋蛋白质两种模式下AAS、CS、EAAI、SRCAA、EAARR这5种化学评分都很高，但前者评价结果高于后者。在两种参考蛋白模式下，蛋氨酸＋胱氨酸都是致敏蛋白α亚基缺失型大豆Cb15、Cb80的第一限制氨基酸，且Cb80的5种化学评分AAS、CS、EAAI、SRCAA、EAARR都高于Cb15。东农47、日B、Cb15、Cb80的SRCAA值非常接近，在FAO/WHO模式下都高约99.80；在全蛋模式下都高约99.70。根据SRCAA值的大小，这4 个材料的排序结果都为：东农47＞Cb80＞日B＞Cb15；根据EAARR值得大小排序，FAO/WHO模式下的结果为日B＞Cb80＞东农47＞Cb15，在全蛋模式下为东农47＞Cb80＞Cb15＞日B。这表明，α亚基缺失不会降低大豆蛋白的营养价值；α亚基缺失大豆蛋白质拥有与正常型大豆蛋白质同样高、甚至更高的营养价值。

2.4.3 模糊识别法的营养评价

表6 致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白质相对于两种模式下标准蛋白的贴近度Table 6 Similarity of a-subunit deficient soybean protein in the FAO/WHO and the whole egg reference patterns

由表6可知，以FAO/WHO模式蛋白为标准，α亚基缺失型大豆Cb15、Cb80的贴进度值与东农47和日B的差别不大，都接近标准蛋白的贴进度，在0.94～0.96之间，大小排序为：日B＞Cb80，东农47＞Cb15。全蛋模式下的贴进度整体上小于FAO/WHO模式，变化范围为0.88～0.91，排序为：东农47＞日B＞Cb15＞Cb80。

3 结 论

致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白质、脂肪、总氨基酸、总必需氨基酸含量不因α亚基缺失而降低；致敏蛋白α亚基缺失型大豆致敏性降低，11S/7S比例更优，氨基酸组成平衡，营养价值较高；α亚基缺失能够改善大豆蛋白的营养品质。

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Amino Acid Composition and Nutritional Assessment of A llergenic Protein α-Subunit-Deficient Soybean Lines

TUO Yun1, HUO Cai-qin2, TIAN Fu-dong3, SHEN Li-wei1, SONG Bo1, LAN Lan1, WEI Xiao-shuang1, GUO Bo-wen1, LI Wen-bin1, LIU Shan-shan1,*
(1. Key Laboratory of Soybean Biology, Ministry of Education, Key Laboratory of Soybean Biology and Breeding/Genetics, Ministry of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Heilongjiang Hetian Feng Ze Agricultural Science and Technology Development Co. Ltd., Harbin 150000, China; 3. Agriculture Science Institute of Tongliao City, Tongliao 028015, China)

Assessment of protein nutritional value by mathematical modeling based on fuzzy pattern recognition according to the FAO/WHO standards and the whole egg protein pattern was conducted on two allergenic protein α-subunitdeficient soybean lines so as to explore the effects of amino acid composition on the nutritional value of soybean with the characteristics of α-subunit defici ency. Amino acids were detected by an automatic amino acid analyzer. SDS-PAGE was used to analyze the confirmation of α-subunit deficiency. A near infrared grain analyzer was used for the determination of protein and oil. The results indicated that the contents of essential amino acids, total amino acids, protein and oil were not decreased in soybean seeds with α-subunit deficiency. Meanwhile, the 11S/7S ratio in soybean seeds with α-subunit deficiency exceeded 4.65, which was higher than known values of 2.0–3.0 for the public. In addition, the content of essential amino acids was similar to or higher than those recommended by the FAO/WHO and the whole egg patterns. Furthermore, the scores from five chemical analysis methods in the two patters and the results from the developed mathematical m odel were similar to the standards in this study. In conclusion, the α-subunit deficient soybean lines have balanced amino acid composition, reasonable 11S/7S ratio, and higher nutrition value.

soybean; α-subunit deficiency; amino acid; nutrition assessment

S565.1

A

1002-6630（2014）09-0224-05

10.7506/spkx1002-6630-201409044

2013-06-28

国家自然科学基金面上项目（31371650；31071440）；黑龙江省普通高等学校青年骨干支持计划项目（1155G12）；转基因生物新品种培育重大专项（2013ZX08004-004）

拓云（1988—），男，硕士研究生，研究方向为大豆遗传育种。E-mail：tuoyun2010@163.com

*通信作者：刘珊珊（1972—），女，教授，博士，研究方向为大豆品质育种。E-mail：ars336699@aliyun.com