芦蒿秸秆黄酮类化合物对晚期蛋白质糖基化终末产物形成的抑制作用

邓荣华，陆 敏，夏秋琴，李晓明，孔阳辉，吕丽爽,*

芦蒿秸秆黄酮类化合物对晚期蛋白质糖基化终末产物形成的抑制作用

邓荣华1,2，陆 敏1，夏秋琴1，李晓明1，孔阳辉1，吕丽爽1,*

(1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.青岛商务学校，山东 青岛 266002)

通过建立牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albumin-methylglyoxal，BSA-MGO）的蛋白质糖基化反应模型，用荧光法测定体外晚期蛋白质糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的含量，探讨芦蒿秸秆黄酮类化合物对AGEs形成的抑制效果，并对木犀草素的作用途径进行探索。结果表明：芦蒿秸秆总黄酮浸膏经AB-8树脂分离后共收集到4组含有黄酮的洗脱组分（F-10、F-30、F-50、F-70）对AGEs的形成均具有抑制作用，抑制效果由强到弱为依次为F-50＞F-30＞F-10＞F-70，此结果与F-30和F-50分离纯化得到的黄酮成分芦丁和木犀草素具有较好的AGEs抑制效果相一致。同时发现，芦蒿秸秆对AGEs形成的抑制效果与总黄酮含量存在显著的线性关系。另外，将木犀草素与MGO的反应产物进行分离纯化，高效液相色谱-质谱联用分析显示：木犀草素作用途径为通过捕获MGO，形成木犀草素-MGO加和物来抑制AGEs的形成。芦蒿秸秆黄酮类化合物可抑制体外蛋白质糖基化反应的活性预示其可以作为AGEs的天然抑制剂来预防和减轻糖尿病及其并发症。

芦蒿秸秆；黄酮类化合物；蛋白质糖基化终末产物

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）是以蛋白质、脂质及核酸的氨基和还原糖为原料，在生理环境中发生非酶催化反应，生成的一类稳定的共价化合物。该反应又称为Maillard反应或非酶促褐变反应[1]。研究者最初认为AGEs只是蛋白质老化的标志，以便体内识别降解、清除老化的蛋白质[2]。近几年的研究表明，AGEs与糖尿病并发症发病机理有关，可以引发神经病变、肾病、视网膜病变、糖尿病以及其他与组织老化相关疾病，如动脉粥样硬化、老年痴呆症、慢性肾脏疾病等[3-5]。因此，如何抑制蛋白质的非酶糖基化是近年来国内外研究的热点。

二羰基化合物，如丙酮醛（methylglyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO）等是还原糖与蛋白质、脂类、DNA发生非酶糖基化反应过程中产生的活性羰基中间体也是AGEs形成的前体物质，并且具有细胞毒性、组织破坏性[6]。二羰基化合物能够促进蛋白质交联反应，甚至破坏蛋白组织的结构和功能，在蛋白质糖基化过程中发挥重要作用[7-9]。

芦蒿（Artemisia selengensis Trucz）是多年生宿根性草本植物，具有药食两用性。根据相关文献报道，芦蒿具有抗氧化、降血压、抑菌、抗肿瘤、保护肝脏等生物活性[10-15]。芦蒿是南京的特色蔬菜，通常废弃或焚烧其秸秆，为进行芦蒿秸秆综合开发，以提高其附加值，本实验前期已研究了黄酮类化合物的富集纯化工艺[16]及其具有的清除自由基活性[17]。而对芦蒿抑制AGEs形成、减轻和预防糖尿病并发症的生理功能尚未有文献报道。本实验建立了牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albuminmethylglyoxal，BSA-MGO）的蛋白质糖基化反应模型，探讨了芦蒿秸秆提取物各洗脱组分及黄酮单体对AGEs形成的抑制作用，并分析了木犀草素的作用途径，为预防糖尿病及其糖尿病并发症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦蒿秸秆采集于南京八卦洲，选择9月份完全成熟的整株秸秆，洗净沥干后，烘至恒质量，粉碎后备用。

BSA 生工生物工程（上海）股份有限公司；40%丙酮醛 美国Sigma公司；甲醇、乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、二甲基亚砜均为分析纯。

1.2 仪器与设备

十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilane chemically bonded silica，ODS） 美国Sunchrom公司；硅胶（Silica gel 40，0.2～0.5 mm） 德国Merck公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶 美国GE Healthcare公司；制备型厚薄层层析硅胶板 烟台江友硅胶开发有限公司；高效液相色谱-质谱联用仪（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）（配有电喷雾离子源（elaectrospray ionization，ESI）） 美国安捷伦公司；Infinite 200Pro TECAN 奥地利Tecan有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芦蒿秸秆总黄酮提取及分离纯化

取芦蒿秸秆粉（600 g），用70%乙醇按料液比1∶15（m/V）搅拌浸提2 次，提取温度90 ℃，提取时间分别为30 min和60 min。合并提取液，于40 ℃减压浓缩得芦蒿秸秆提取物浓缩液[19]。石油醚萃取数次去除叶绿素、油脂等杂质，醇沉法除去其中的大部分蛋白质和多糖[20-21]。于45 ℃将滤液旋转蒸发，回收乙醇，提取物经冷冻干燥备用。

通过对比NKA-Ⅱ、AB-8、HPD417、DM130、D101、HPD826、ADS-17、聚酰胺8种树脂静态吸附和解吸性能，筛选出性能最佳的AB-8大孔吸附树脂作为本实验树脂，最优条件参照文献[16]。将经预处理的芦蒿秸秆提取物上样AB-8大孔树脂，采用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇依次梯度洗脱得到5种不同洗脱组分，将不同体积分数乙醇洗脱组分冷冻干燥分别得到F-10、F-30、F-50、F-70 初步分离组分。

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法进行测定吸光度A[22]，代入标准曲线ρ=0.090 4A－0.000 9（R2=0.999 9）得到总黄酮质量浓度（ρ，mg/mL），并换算为每克干质量样品中总黄酮的质量（mg）。

将总黄酮含量最高的AB-8洗脱组分（F-30、F-50）分别经ODS柱，硅胶柱分离纯化，Sephadex LH-20进一步纯化，并结合薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）跟踪检测，得到化合物1和化合物2。

1.3.2 高效液相色谱及质谱分析条件

采用HPLC-MS联用技术对其化合物结构进行分析。

化合物1：采用Agilent1200型高效液相色谱分析。用甲醇溶解样品，色谱条件：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 øm）色谱柱；流动相：A为水-0.01%乙酸、B为乙腈，梯度洗脱：0～10 min（10% B）；10～20 min（10%～60% B）；20～25 min（60% B）。流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；波长：350 nm。DAD检测器：Scan（200～600 nm）。

化合物2：采用HPLC-ESI-MS分析。用甲醇溶解样品，色谱条件：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 øm）色谱柱；流动相：A为水-0.5%甲酸、B为乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脱：0～10 min（12% B），10～30 min（12%～20% B），30～40 min（20%～30% B），40～48 min（30%～60% B），48～49 min（60%～12% B），49～55 min（12% B）。流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；波长：254 nm。

质谱条件：离子源：ESI；负离子检出模式；喷雾压力310.28 kPa；干燥器温度350 ℃；干燥气流速11 L/min；毛细管温度为350 ℃，毛细管电压3.5 kV；分子质量扫描范围：m/z 100～1 500 u；载气为高纯度氮气。

1.3.3 体外蛋白糖基化抑制实验

反应液：BSA 2.8 mg/mL，MGO 1 mmol/L，临用前用pH 7.4，0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphat buffered saline，PBS）配制。

芦蒿秸秆AB-8树脂梯度洗脱物，用PBS配制成2 mg/mL溶液。将上述反应液1 mL于具塞试管中，分别加入芦蒿秸秆梯度洗脱物样品溶液1 mL，并将试管密封为样品组，以PBS溶液代替样品溶液为空白组。置37 ℃培养箱中孵育7 d，形成糖基化修饰的白蛋白（AGE-BSA）[23]。

将芦丁和木犀草素标准品，用少量的二甲基亚砜溶解，用pH 7.4 PBS分别配制成0.5、1、2、5 mmol/L。将上述反应液与样品溶液各1 mL等体积混合，将试管密封为阳性组，置37 ℃培养箱中孵育7 d，形成AGE-BSA。

利用AGE-BSA在激发波长370 nm，发射波长450 nm有特征性吸收光谱，采用荧光光谱分析法测定其形成的AGE-BSA含量。代入下式计算AGEs抑制率。

1.3.4 木犀草素与MGO反应产物的分析

将木犀草素与MGO以物质的量比1∶10与pH 7.4、0.2 mol/L PBS混合，置于37 ℃培养箱中培养48 h，反应产物经Sephadex LH20凝胶分离纯化，按照1.3.2节化合物2的HPLC-MS条件对其纯化产物进行鉴定。

1.4 统计学分析

使用SPSS StatistiVcs 17.0软件对数据进行统计学分析。测定结果以x±s表示，显著性检验为t检验，显著性水平为P＜0.05，极显著性水平为P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 芦蒿秸秆AB-8大孔吸附树脂洗脱组分总黄酮含量

表1 AB-8梯度洗脱物黄酮含量Table 1 Flavonoid contents of fractions eluted from AB-8 resin

如表1所示，F-50组分总黄酮含量最高，达958 mg/g干质量；F-30组分次之，为893 mg/g干质量。F-10、F-70组分总黄酮含量明显小于F-30和F-50组分。

2.2 芦蒿秸秆AB-8树脂梯度洗脱组分对AGEs的抑制作用

图1 芦蒿秸秆AB-8梯度洗脱物对AGEs的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of four elution fractions from AB-8 resin on the formation of AGEs

由图1可知，各梯度洗脱物对AGEs形成的抑制效果存在显著性差异，抑制效果由强到弱依次为F-50＞F-30＞F-10＞F-70。在BSA-MGO模型中，F-50对AGEs的抑制率达78.84%；F-30对AGEs的抑制率为66.82%。

2.3 芦蒿秸秆分离组分对AGEs抑制率与总黄酮含量之间的关系

图2 总黄酮含量与AGEs抑制率的线性关系（BSA-MGO模型）Fig.2 Linear relationship between inhibition of AGE formation and total flavonoid contents in the BSA-MGO model

由表1和图2可知，总黄酮含量与AGEs抑制率存在一定的线性关系（R2=0.948）。由此可推断芦蒿秸秆提取物对AGEs形成的抑制作用与总黄酮含量密切相关。代入方程y=0.076 5x＋4.456 6计算得，芦蒿秸秆中黄酮类化合物对BSA-MGO模型产生的AGEs半数抑制浓度为IC50=591 mg/g干质量。

2.4 芦蒿秸秆组分（F-30和F-50）主要成分

鉴于芦蒿秸秆分离组分F-50和F-30具有高活性抑制AGEs形成的功效，本研究对两组分进行进一步的分离纯化和结构鉴定。

通过对F-30组分进一步分离得到化合物1：黄绿色粉末，溶于氯仿、丙酮、甲醇等有机试剂，不溶于水。HPLC-MS分析结果如图3所示，保留时间为15.173 min，单峰；ESI-MS m/z609.2 [M－H]－，则化合物1的分子质量为610 D，与芦丁标准品分析结果一致，由此可判断化合物1为芦丁。

图3 化合物1液相色谱（A）及质谱图（B）Fig.3 HPLC chromatogram (A) and mass spectrum (B) of compound 1

图4 化合物2液相色谱（A）及质谱图（B）Fig.4 HPLC chromatogram (A) and mass spectrum (B) of compound 2

通过对F-50组分进一步分离得到化合物2：浅黄色粉末，溶于乙醇、甲醇溶液，不溶于冷水。HPLC-MS分析结果如图4所示，出峰保留时间47.325 min，单峰；ESI-MS m/z 285 [M－H]－，则化合物2的分子质量为286 D，与木犀草素标准品的分析数据一致，由此可判断化合物2为木犀草素。

2.5 芦丁、木犀草素对AGEs的抑制作用

由图5可知，木犀草素和芦丁均能够显著抑制AGEs的形成，且抑制效果均随着浓度的增加而提高。分析数据可知木犀草素在浓度为0.5～2.5 mmol/L之间无显著性差异，而芦丁在浓度为0.25～1.0 mmol/L之间差异性显著。在浓度为2.5 mmol/L时，芦丁AGEs抑制率达到89%；木犀草素在浓度为1 mmol/L时， AGEs抑制率为81%。在浓度低于1 mmol/L时，木犀草素的抑制效果优于芦丁，说明木犀草素捕获MGO的能力强于芦丁，木犀草素在低浓度下，仍具有较强的捕获二羰基化合物的能力，可以作为AGEs的天然抑制剂。

图5 木犀草素和芦丁对AGEs的抑制作用（BSA-MGO模型）Fig.5 Inhibitory effects of luteolin and rutin on the formation of AGEs in the BSA-MGO model

2.6 木犀草素与MGO作用途径

图6 木犀草素与MGO反应产物液相色谱（A）及质谱图（B）Fig.6 HPLC (A) and mass spectrum (B) of the adduct formed from the reaction between luteolin and MGO

由图6可知，准离子峰m/z 357[M－H]－，推断该产物的分子质量为358 D。而木犀草素分子质量为286 D，产物的准离子峰357[M－H]－恰为木犀草素与MGO的加合物[286＋72－H]－，由此推测木犀草素与MGO反应方程式：C15H10O6（木犀草素）＋C3H4O6（MGO）→C18H14O8（加合物）。

木犀草素与MGO反应后，产物为木犀草素与MGO的加合物，表明木犀草素抑制AGEs形成的作用途径为通过捕获MGO，形成木犀草素-MGO加合物来抑制AGEs的形成，这与国外文献报道其他黄酮类化合物作用途径相一致[24-25]，而其具体作用机理有待进一步考证。

3 讨 论

近年来，蛋白质糖基化反应作为糖尿病并发症的发病机理的有力学说已得到医学生物学界的普遍认可。研究发现[26-29]，二羰基化合物在人体血浆中的浓度为0.3～1.5 μmol/L，而在糖尿病患者体内浓度很高。二羰基化合物能够促进蛋白质交联反应，甚至破坏蛋白组织的结构和功能，在蛋白质糖基化过程中发挥重要作用。因此，开发天然AGEs抑制剂，研究其对AGEs形成的抑制效果及作用机理，对探讨非酶糖基化机制和预防糖尿病并发症具有重要意义。

本实验建立了BSA-MGO的蛋白质糖基化反应模型，结果显示：芦蒿秸秆AB-8梯度洗脱物对AGEs的形成均具有较好的抑制作用，抑制效果为F-50＞F-30＞F-10＞F-70，F-50对AGEs的抑制率达78.84%。通过对各组分总黄酮类化合物分析发现：芦蒿秸秆组分对AGEs形成的抑制效果与总黄酮含量存在较为显著的线性关系。由此推断，芦蒿秸秆提取物中抑制AGEs形成的主要组分为黄酮类化合物。

为探究芦蒿秸秆中抑制AGEs形成的具体化合物，将黄酮含量最高的AB-8洗脱组分（F-30、F-50）分离得到2 种黄酮单体：芦丁和木犀草素。实验结果显示，二者对AGEs的形成具有低浓度，高活性的抑制效果。木犀草素在浓度为1 mmol/L时，对BSA-MGO形成的AGEs抑制率为81%。将木犀草素与MGO的反应产物进行分离和HPLC-MS分析，发现木犀草素的作用途径为通过捕获MGO，形成木犀草素-MGO加和物来抑制AGEs的形成。木犀草素因其较强的捕获二羰基化合物的能力，可以作为AGEs的天然抑制剂。

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Inhibitory Effect of Artemisia selengensis Straw Flavonoids on the Formation of Advanced Glycation End Products (AGEs)

DENG Rong-hua1,2, LU Min1, XIA Qiu-qin1, LI Xiao-ming1, KONG Yang-hui1, LÜ Li-shuang1,*
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. Qingdao Commerce School, Qingdao 266002, China)

The inhibitory activity of flavonoids from Artemisia selengensis straw against the formation of fluorescent advanced glycation end products (AGEs) was evaluated in a bovine serum albumin-methylglyoxal (BSA-MGO) model. The formation of total AGEs could be generally followed by measuring their characteristic fluorescence at the excitation and emission maxima of 370 and 440 nm, respectively. Results indicated that 4 elution fractions (F-10, F-30, F-50 and F-70) obtained with AB-8 resin from the flavonoid extract of Artemisia selengensis straw revealed significant inhibitory activities against the formation of AGEs in decreasing order: F-50 ＞ F-30 ＞ F-10 ＞ F-70, which was consistent with the inhibitory effects of rutin and luteolin purified from F-30 and F-50 against the formation of AGEs. Meanwhile, the inhibitory activities of elution fractions were found to be linearly correlated with their total flavonoid contents. The adduct formed from the reaction between luteolin and MGO was purified, and LC-MS analysis showed that luteolin might have the potential to inhibit the formation of AGEs by trapping MGO to form a di-MGO conjugated adduct. Our findings showed that the flavonoids from Artemisia selengensis straw could inhibit the formation of AGEs in vitro, implying their potential use as a new inhibitor for preventing and alleviating diabetes and diabetes-related complications.

Artemisia selengensis straw; flavonoid; advanced glycation end products (AGEs)

TS201.2

A

1002-6630（2014）09-0123-05

10.7506/spkx1002-6630-201409025

2013-06-13

江苏省普通高校研究生科研创新计划立项项目（CXLX11_0893；CXLX12_0417）；江苏省自然科学基金项目（BK2012850）；江苏省高校自然科学基金项目（12KJB5500005）；浙江省自然科学基金项目（LY12C15001）

邓荣华（1987—），女，硕士研究生，研究方向为食源性功能因子分离及活性。E-mail：lovedrh_123@163.com

*通信作者：吕丽爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向为天然产物的分离纯化、生物活性及其构效。

E-mail：lishuanglv@126.com