蛋清肽的制备及其对保加利亚乳杆菌促生长的作用

任 静，孙 波*，赵 晓，孙欣瑶，齐 玉，李海鑫，樊 庆，孙 盛

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

蛋清肽的制备及其对保加利亚乳杆菌促生长的作用

任 静，孙 波*，赵 晓，孙欣瑶，齐 玉，李海鑫，樊 庆，孙 盛

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

研究Alcalase碱性蛋白酶酶解蛋清制备蛋清肽和蛋清肽对保加利亚乳杆菌生长的影响。结果表明：通过Box-Behnken设计确定酶解的最佳工艺为：底物质量浓度4.5 g/100 mL、酶解pH 9.0、酶解温度64℃、加酶量（[E]/[S]）5.0%，此条件下，酶解3 h后水解度达21.89%。蛋清肽可显著促进保加利亚乳杆菌生长，当添加体积分数3.0%、酶解3 h的蛋清肽（分子质量主要集中在1 513 u）时，其促生长效果最好，此时，与未添加蛋清肽组相比，活菌数提高了1（lg（CFU/mL））。

蛋清肽；保加利亚乳杆菌；促生长

保加利亚乳杆菌作为我国卫生部列出的9类益生菌之一，其在食品、医疗保健等领域的应用越来越广[1-3]。然而，国际和国内规定中声明，益生菌活菌数不得少于106CFU/mL或106CFU/g，否则不能产生渴望的健康诉求[4]，因此，如何促进保加利亚乳杆菌快速生长、提高保加利亚乳杆 菌的活菌数量则成为大规模酶制剂生产中的一项重要任务。

蛋清肽是蛋清经蛋白酶适度水解生成的多肽混合物，蛋清中含有丰富的蛋白质和人体必需的多种氨基酸，且氨基酸组成配比均衡性好，是营养学界公认的机体利用率最高、最优质的蛋白质[5-6]。水解后的蛋清肽不仅分子质量小，利于吸收，且许多具有独特序列的肽还具有特殊的生理功效[7-11]。近年来，国内外已有相关研究报道乳蛋白、绿豆蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、鱼蛋白来源的肽具有不同程度促进乳酸菌生长的影响[12-18]，然而，有关蛋清肽对乳酸菌生长的影响鲜见报道。

本实验以鸡蛋蛋清为原料，采用Alcalase碱性蛋白酶酶解制备蛋清肽，利用Box-Behnken响应面分析法优化蛋清肽制备工艺，并进一步探讨蛋清肽对保加利亚乳杆菌生长的影响，旨在为提高保加利亚乳杆菌的活菌数量、促进蛋清肽在乳制品生产中的应用提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋 市售。

Alcalase碱性蛋白酶（24万U/mL） 诺维信生物制品有限公司；Sephadex G-25 美国Pharmacia公司。

1.2 菌种与培养基

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus） 东北农业大学食品学院保藏。

MRS培养基（g/L）：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、酵母膏5.0、无水乙酸钠5.0、柠檬酸二铵2.0、硫酸镁0.58、硫酸锰0.28、琼脂15.0、吐温-80 1.0 mL/L，pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。

1.3 仪器与设备

HYP-Ⅱ型消化炉 上海纤检仪器有限公司；JJ-1型电动搅拌器 常州国华电器有限公司；HD-1型核酸蛋白检测仪 金坛市盛蓝仪器制造有限公司；PHS-3C型精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；CJ-2D型超净工作台 天津泰斯特仪器有限公司；TDZ4低速离心机上海平凡仪器仪表有限公司；DHP-9162恒温培养箱、HWS-24电热恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司；722可见分光光度计 天津市普瑞斯仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 蛋清肽的制备

称取一定量搅打后的鸡蛋蛋清，加水稀释至一定蛋白质质量浓度后，沸水浴加热处理15 min，加入Alcalase碱性蛋白酶酶解，酶解后95 ℃保温10 min灭酶，冷却，4 000 r/min离心30 min，上清液即为蛋清肽。

1.4.2 水解度的测定

采用茚三酮比色法[19]测定。

1.4.3 蛋清肽分子质量测定

采用凝胶柱层析法测定蛋清肽的分子质量分布。层析条件为：Sephadex G-25柱（2.6 cm×50 cm），流速1.0 mL/min，0.1 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液洗脱；温度23 ℃；检测波长280 nm。

取苯丙氨酸（Mw=168 u）、还原型谷胱甘肽（Mw=307 u）、氧化型谷胱甘肽（Mw=612 u）、杆菌肽（Mw=1 422 u）、溶菌酶（Mw=14 000 u）各10 mg，分别溶于1 mL洗脱液中，制成标准溶液。将处理好的交联葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）装柱，按照上述条件操作，用记录仪记录流出液吸收情况。洗脱液洗脱至基线平稳，加入标准溶液或样品0.2 mL，用量筒记录最大吸收峰出现时洗脱液流出体积。

1.4.4 保加利亚乳杆菌活菌数测定

参照GB/T 4789.35—2010《食品微生物检验 食品中乳酸菌检验》方法测定。

1.4.5 滴定酸度测定

参照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》方法测定。

2 结果与分析

2.1 蛋清肽酶解工艺条件的优化

2.1.1 酶解pH值对水解度的影响

pH值是酶促反应的重要参数，其过高或过低均会抑制酶的活性，进而降低反应速率。底物质 量浓度4.0 g/100 mL、酶解温度60 ℃、加酶量（[E]/[S]）4.0%、酶解3 h，研究pH值对蛋清肽水解度的影响，结果如图1所示，pH值以9.0为宜。

图1 酶解pH值对蛋清肽水解度的影响Fig.1 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.2 酶解温度对水解度的影响

底物质量浓度4.0 g/100 mL、加酶量4.0%、酶解pH 9.0、酶解3 h，研究酶解温度对蛋清肽水解度的影响，结果如图2所示，当温度低于65 ℃时，随着酶解温度的升高，水解度也随之增加，但当酶解温度大于65 ℃时，随着酶解温度的升高，水解度显著下降，可见，过高的温度破坏了酶的活性中心，改变了酶的构象，进而导致酶切作用迅速降低，因此，本实验中，温度以65 ℃为宜。

图2 酶解温度对蛋清肽水解度的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3 底物质量浓度对水解度的影响

图3 底物质量浓度对蛋清肽水解度的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

底物质量浓度过高，加热变性后蛋白凝固而形成凝胶状，不利于酶的作用；底物质量浓度过低，又会降低生产效率。加酶量4.0%、酶解pH 9.0、酶解温度65 ℃、酶解3 h，研究底物质量浓度对蛋清肽水解度的影响，结果如图3所示，底物质量浓度以4.5 g/100 mL为宜。

2.1.4 加酶量对水解度的影响

加酶量越大，其与底物蛋白接触的几率越大，水解度也会随之增加，但加酶量过大则会造成资源浪费，成本增加。底物质量浓度4.5 g/100 mL、酶解pH 9.0、酶解温度65 ℃、酶解3 h，研究加酶量对蛋清肽水解度的影响，结果如图4所示，加酶量以6.0%为宜。

图4 加酶量对蛋清肽水解度的影响Fig.4 Effect of enzyme concentration on the degree of hydrolysis

2.1.5 响应面法优化蛋清肽酶解工艺

表1 响应面分析试验设计及结果Table 1 Experiment design and results for response surface analysis

在单因素试验基础上，选取蛋清肽酶解工艺中的4个因素，即酶解pH值、酶解温度、底物质量浓度、加酶量为自变量，分别用x1、x2、x3、x4表示，以水解度Y为响应值，采用Design-Expert 7.0软件中的Box-Behnken响应面设计原理设计响应面分析试验，其结果见表1。

通过统计分析软件Design-Expert 7.0对表1中试验数据进行二次多项式回归拟合，得二元回归方程为：

Y=21.06－0.037x1－0.42x2－0.23x3－2.10x4－0.71x1x2＋0.12x1x3＋0.25x1x4－0.50x2x3＋0.19x2x4－0.035 x3x4－2.23x12－1.20x22－1.59x32－1.38x42

表2 模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the response surface regression model

对模型进行方差分析，结果见表2，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型显著（P＜0.01），失拟项不显著，且该模型相关系数R2=99.81%，校正决定系数表明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可用于该反应的理论推测。由F检验得各因子的贡献率依次为：x4＞x2＞x3＞x1，即加酶量＞酶解温度＞底物质量浓度＞酶解pH值。由显著性分析可知，x2、x3、x4、x1x2、x1x4、x2x3、x2x4、x12、x22、项达到了极显著的水平。

图5 各因素两两相互作用对蛋清肽水解度影响的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the pairwise effects of four process conditions on the degree of hydrolysis of egg white

由图5各因素对蛋清肽水解度影响的响应面和等高线图可知，酶解pH值和酶解温度、酶解pH值和加酶量、酶解温度和底物质量浓度、酶解温度和加酶量之间交互作用显著。

2.1.6 验证实验

应用响应面法对回归模型进行分析，确定蛋清肽酶解的最佳工艺条件为：酶解pH 8.99、酶解温度63.87 ℃、底物质量浓度4.49 g/100 mL、加酶量5.22%；综合考虑实际可操作性，将蛋清肽酶解的最佳工艺条件修整为：酶解pH 9.0、酶解温度64 ℃、底物质量浓度4.5 g/100 mL、加酶量5.0%。在最优条件下对响应面法优化的结果进行验证，3次平行实验水解度的平均值为21.89%，接近Design Expert 7.0软件得到的预测值21.93%，由此证明此响应面试验参数准确，实验模式合理。

2.1.7 蛋清肽分子质量的测定结果

一定分子质量的物质通过葡聚糖凝胶柱的时间或洗脱体积与分子质量的对数呈线性关系，分子质量越大，其通过凝胶柱的时间越短，洗脱体积越小[20]。按照1.4.3节所述的方法进行实验，以各标准品分子质量对数为横坐标（x），洗脱体积为纵坐标（y）绘制分子质量标准曲线，其回归方程为y=－34.01x＋185.6（R2= 0.998 7），表明二者线性关系良好，可以用于分子质量的测定。

表3 不同酶解时间下蛋清肽的出峰体积及分子质量Table 3 Elution volumes and molecular weights of egg white peptides at different time points of hydrolysis

如表3和图6所示，未水解的蛋清肽的出峰体积较小，为44 mL，其分子质量较大，为14 454 u；随着酶解时间的延长，洗脱体积在44 mL处峰高越来越小，且最高峰逐渐后移，表明高分子质量蛋白逐渐被水解，分子质量逐渐变小；当酶解时间大于3 h时，随着酶解时间的延长，其最高峰处的洗脱体积变化不大，最高峰的洗脱体积在77～78 mL之间，分子质量在1 513～1 445 u。

2.2 蛋清肽对保加利亚乳杆菌生长的影响

2.2.1 蛋清肽分子质量对保加利亚乳杆菌生长的影响

图7 酶解时间对保加利亚乳杆菌生长的影响Fig.7 Effect of egg white peptides at different time points of hydrolysis on the growth of Lactobacillus bulgaricus

肽功能性与分子质量密切相关[21]。本实验将已活化的保加利亚乳杆菌按体积分数3%接种量接种于MRS液体培养基中，并分别加入1%最佳酶解工艺条件下不同酶解时间（0、1、2、3、4 h）的蛋清肽，同时以乙酸铵（无机氮源）作为对照组，使各组培养基的含氮量相同，37 ℃培养24 h后测定各组发酵液的活菌数及滴定酸度，以此来初步研究蛋清肽分子质量对保加利亚乳杆菌生长的影响。由图6、7可知，蛋清肽可显著促进保加利亚乳杆菌的生长，且随着酶解时间的延长，小分子质量肽段逐渐增多，其对保加利亚乳杆菌的促生长作用逐渐增强，但当酶解时间大于3 h时，小分子质量肽段含量几乎不变，其促生长作用也增加缓慢，可见，肽分子质量越小，其促生长作用越强，这与Lucas等[13]的研究结果一致。针对本实验蛋清肽促生长作用而言，蛋清肽的酶解时间以3 h为宜，此条件下制得的蛋清肽主要为分子质量集中于1 513 u的肽段（表3）。

2.2.2 蛋清肽添加量对保加利亚乳杆菌生长的影响

图8 蛋清肽添加量对保加利亚乳杆菌生长的影响Fig.8 Effect of egg white peptide concentration on the growth of Lactobacillus bulgaricus

本实验在保加利亚乳杆菌接种量为3%的MRS液体培养基中，分别加入1%、2%、3%、4%、5%最佳酶解工艺条件下酶解3 h的蛋清肽，以未添加蛋清肽作为对照，37 ℃培养24 h后，分别测定各组发酵液中的活菌数及滴定酸度，结果如图8所示，蛋清肽的添加量显著影响保加利亚乳杆菌的生长。当蛋清肽添加量为1.0%～3.0%时，随着添加量的增加，保加利亚乳杆菌的活菌数及滴定酸度增加；当蛋清肽添加量为3.0%时，保加利亚乳杆菌的活菌数最多，为5.0×108CFU/mL，与对照组（2.8×107CFU/mL）相比，增加了一个数量级，这可能与添加蛋清肽增加了发酵液中肽和氨基酸的含量，提高乳酸菌生长所需的较理想的氮源密切相关；当蛋清肽添加量大于3.0%时，随着添加量增加，保加利亚乳杆菌活菌数及滴定酸度逐渐降低，促生长作用逐渐减小；但当添加量为5.0%时，其对保加利亚乳杆菌生长具有抑制作用，这与胡志和等[16]的研究趋势相同。可见，蛋清肽对保加利亚乳杆菌的促生长作用存在最适浓度范围，并非添加量越大越好。

3 结 论

本实验以鸡蛋蛋清为原料，采用Alacase碱性蛋白酶酶解制备蛋清肽，确定其最佳制备工艺为：酶解pH 9.0、酶解温度64 ℃、底物质量浓度4.5 g/100 mL、加酶量5.0%。此条件下，酶解3 h后其水解度达21.89%。

研究了蛋清肽对保加利亚乳杆菌生长的影响，结果表明，蛋清肽可显著促进保加利亚乳杆菌生长，且随着肽分子质量的减小，其促生长作用越强；此外，实验中发现，蛋清肽对保加利亚乳杆菌的促生长作用存在最适浓度范围，当添加3.0%、酶解3 h的蛋清肽时（分子质量主要集中在1 513 u），其对保加利亚乳杆菌的促生长作用最强，与未添加相比，可使活菌数提高一个数量级。

蛋清肽制备工艺简单、操作方便，且廉价的蛋清肽可显著促进保加利亚乳杆菌生长，降低生产成本，提高经济效益，这不仅为保加利亚乳杆菌菌剂的大规模生产提供了一个新的途径，同时也拓宽了蛋清肽的应用领域，提高了鸡蛋的附加值，其应用前景广阔。

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Preparation of Egg White Peptide and Its Growth-Promoting Activity for Lactobacillus bulgaricus

REN Jing, SUN Bo*, ZHAO Xiao, SUN Xin-yao, QI Yu, LI Hai-xin, FAN Qing, SUN Sheng
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Egg white was hydrolyzed by Alcalase to prepare egg white peptide in this study. The optimal hydrolysis parameters were determined by Box-Behnken experimental design as 4.5 g/100 mL substrate concentration, pH 9.0, 64 ℃ and 5.0% [E]/[S] ratio, yielding a degree of hydrolysis as high as 21.89% in 3 h of hydrolysis. Egg white peptide could obviously promote the growth of Lactobacillus bulgaricus. The best growth-promoting effect was achieved by addition of 3.0% by volume of egg white hydrolyzed for 3 h (mostly peptides with a molecular weight of 1 513 u), increasing the number of viable cells by 1 (lg(CFU/mL)) when compared with the blank control.

egg white peptide; Lactobacillus bulgaricus; growth-promoting

TS201.3

A

1002-6630（2014）07-0170-06

10.7506/spkx1002-6630-201407034

2013-03-04

任静（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物与发酵工程。E-mail：renjing114@163.com

*通信作者：孙波（1962—），男，副教授，硕士，研究方向为食品微生物与发酵工程。E-mail：bosun114@163.com