UPLC-ESI-MS-MS结合QuEChERS同时测定柑橘中的4 种真菌毒素

史文景，赵其阳，焦必宁,3,*

（1.农业部柑桔产品质量安全风险评估实验室（重庆），西南大学柑桔研究所，重庆 400712；2.西南大学园艺园林学院，重庆 400715；3.国家柑桔工程技术研究中心，中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712）

UPLC-ESI-MS-MS结合QuEChERS同时测定柑橘中的4 种真菌毒素

史文景1,2，赵其阳1，焦必宁1,2,3,*

（1.农业部柑桔产品质量安全风险评估实验室（重庆），西南大学柑桔研究所，重庆 400712；2.西南大学园艺园林学院，重庆 400715；3.国家柑桔工程技术研究中心，中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712）

建立同时检测柑橘中链格孢酚甲基乙醚、交链孢酚、腾毒素和橘青霉素4 种真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色谱-质谱分析方法。待测样品经乙腈提取，无水MgSO4和NaCl脱水盐析，C18键合相分散萃取净化，以ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱为分离柱，以0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相梯度洗脱，在电喷雾离 子源电离、多反应监测模式条件下进行测定，外标法定量。该方法在5.0～200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数（R2）不小于0.992 7，检出限为0.2～0.7 μg/kg。3 个不同加标水平的平均回收率为78.0%～103.3%，相对标准偏差为2.6%～10.6%。结果表明，该方法快速、准确、灵敏，适用于柑橘中4 种真菌毒素残留的快速确证检测。

超高效液相色谱-电喷雾质谱；QuEChERS；柑橘；真菌毒素

链格孢属褐斑病和绿霉病是柑橘贮藏期间的常发病害，分别是由互隔交链孢霉（Alternaria alternata）[1]和指状青霉（Penicillium digitatum）[2]引起的。互隔交链孢霉能产生腾毒素（tentoxin，TEN）、链格孢酚甲基乙醚（aletrnariol monomethyl ether，AME）和链格孢酚（alternario l，AOH）等多种链格孢霉毒素[3-4]，指状青霉是橘青霉素（citrinin，CIT）的重要产生菌之一[5]。这些真菌毒素具有致癌性、细胞毒性、基因毒性等毒性作用[6-8]，对人体健康有潜在的危害。但是，目前我国现行的食品中真菌毒素的限量标准中并未包括链格孢霉毒素和橘青霉素[9]，并且我国尚未制定柑橘类水果中真菌毒素检测的标准方法。因此，建立柑橘类水果中快速、灵敏、准确的真菌毒素检测方法具有十分重要的意义。

真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）法[10]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[11]、高效液相色谱-质谱（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLCMS-MS）法[12-14]、毛细管电泳[15]和免疫学检测方法[16]等。江涛等[10]利用薄层色谱法测定大米中的橘青霉素，检出限高于30 μg/kg，灵敏度低。陈月萌等[11]利用高效液相色谱-荧光检测法测定水果中的3 种链格孢霉毒素，方法平均回收率均在78.2%～103.6%，相对标准偏差均小于8.6%，检出限为2.0～8.0 μg/kg。还有研究者[12-14]利用超高效液相色谱-质谱法分别测定了苹果汁、橙汁和番茄中的链格孢霉毒素，检出限为0.1～4.0 μg/kg、灵敏度高，前处理步骤分别采用PS DVB固相萃取柱、凝胶色谱和Bond Elut Plexa固相萃取柱净化，净化效果好，但操作较为繁琐、耗时，且成本高。杜建中等[15]利用毛细管电泳测定霉变食品中的橘青霉素，微量、快速、高效，检出限为2.1 μg/mL，灵敏度低。但目前还未见有相关同时检测柑橘水果中的链格孢霉毒素和橘青霉素的方法报道。

QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）方法具有回收率高、试剂用量少、简单、快速等优点[17-19]，适用于大量样品的检测。超高效液相色谱-质谱法可同时用于定性和定量分析，具有检出限低、灵敏度高等优点[20-22]。本实验以改进的QuEChERS方法结合超高效液相色谱-电喷雾质谱（ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS-MS）法同时测定柑橘中的腾毒素、链格孢酚甲基乙醚、链格孢酚和橘青霉素4 种真菌毒素，方法快速、准确、灵敏，适用于柑橘类水果中4 种真菌毒素的确证检测。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

腾毒素、链格孢酚甲基乙醚、链格孢酚和橘青霉素标准品 新加坡Pribolab公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化炭黑（graphitized carbon blacks，GCB）、乙腈和甲醇（色谱纯） 上海安谱科学仪器有限公司；无水硫酸镁（分析纯） 江苏强盛化工有限公司；氯化钠（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；C18键合相 大连思谱精工有限公司；甲酸（分析纯） 重庆川东化工有限公司。

Quatrro-Premier XE超高效液相色谱-质谱仪、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美国Waters公司；KS260摇床、Vortex Genius 3涡旋混合器德国IKA公司；3K15离心机 德国Sigma公司；MDF-382E（N）超低温冰箱 日本三洋公司；Milli-Q A10超纯水器 美国Millipore公司；0.22 μm有机滤膜 中国捷盛依科科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准贮备液：取真菌毒素标准品1 mg，用乙腈溶解并定容至25 mL，得到40 mg/L的真菌毒素母液，置于－50 ℃保存。

标准工作液：分别配制2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/L和0.05 mg/L的4种真菌毒素的混合溶液，置于－50 ℃保存。

基质空白标准工作溶液：以不含真菌毒素的柑橘果实为材料，利用本实验前处理方法分别制备柑橘果皮、全果和果肉的基质空白溶液。用基质空白溶液将标准工作液按相同比例稀释至0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L和0.005 mg/L，分别得到柑橘果皮、全果和果肉基质空白标准工作溶液。

1.2.2 样品提取和净化

准确称取柑橘全果、果肉和果皮样品各10 g（准确至0.01 g），加入乙腈10 mL（准确至0.01 mL），摇床振荡提取30 min（300 r/min）；加入3.0 g无水MgSO4和1.0 g NaCl，剧烈振荡1 min，离心（4 000 r/min，5 min）；取上清液2.0 mL，加入30 mg C18，涡旋3 min，离心（4 000 r/min，5 min）；0.22 μm有机滤膜过滤，UPLC-ESI-MS-MS分析。

1.2.3 仪器实验条件

1.2.3.1 UPLC条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18液相色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；流动相体系为0.1%甲酸溶液和乙腈；梯度洗脱程序：在0～5 min，乙腈由20%线性递增至80%，保持2 min，在0.1 min内恢复至20%，并保持1 min；进样量：3 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.3.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源，正离子模式（ESI＋）和负离子模式（ESI－）；质谱扫描方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；电离电压3 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂温度360 ℃，脱溶剂气流量800 L/h，碰撞气流量0.2 L/min，锥孔反吹气流量50 L/h。4种真菌毒素的监测离子、锥孔电压和碰撞电压等质谱参数如表1所示。

表1 4 种真菌毒素的串联质谱测定参数Table1 MS-MS parameters for four mycotoxins

2 结果与分析

2.1 改进QuEChERS方法

2.1.1 除水剂用量的优化

QuEChERS方法以无水MgSO4为除水剂，并结合NaC l的盐析作用，除去样品中的水分和杂质，使目标物能够充分溶解在有机相中。本实验考察了无水MgSO4用量对添加回收率的影响，如图1所示，当无水MgSO4的用量为2.0～3.0 g时，4种真菌毒素的添加回收率均上升，并且在无水MgSO4的用量为3.0 g时，4种真菌毒素的添加回收率均较理想；在3.0～5.0 g范围内，链格孢酚和橘青霉素的添加回收率降低，腾毒素和链格孢酚甲基乙醚的添加回收率变化不大。因此，选取无水MgSO4的用量为3.0 g。

图1 无水MgSO4用量对4 种真菌毒素回收率的影响（加标量0.1 mg/kg）Fig.1 Effect of anhydrous MgSO4amount on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.1.2 净化剂及用量优化

GCB、PSA、C18是QuEChERS方法常用的净化剂，本实验考察3种净化剂及其用量对4 种真菌毒素添加回收率的影响。GCB主要用于净化色素含量较高的样品，以GCB作为净化剂，4 种真菌毒素的添加回收率均低于70%；以PSA作为净化剂，腾毒素、链格孢酚甲基乙醚和链格孢酚 均能得到较好的添加回收率，但是橘青霉素添加回收率低，并且随着PSA用量增加，回收率下降；以C18作为净化剂，4 种真菌毒素均能得到良好的添加回收率。如图2所示，当C18用量为30 mg时，4 种真菌毒素的添加回收率最为理想。

图2 C18用量对4 种真菌毒素回收率的影响（加标量0.1 mg/kg）Fig.2 Effect of C18dose on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.1.3 提取时间的优化

本实验以乙腈作为提取剂，以振荡提取作为提取方法，考察提取时间对于4 种真菌毒素添加回收率的影响。如图3所示，当提取时间为15～30 min时，4 种真菌毒素的添加回收率均有所提高，其中链格孢酚甲基乙醚最为明显；当提取时间大于30 min，4 种毒素的添加回收率的提高并不明显。因此，本实验确定提取时间为30 min。

图3 提取时间对4 种真菌毒素回收率的影响（加标量0.1 mg/kg）Fig.3 Effect of extraction time on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.2 色谱和质谱条件的优化

本实验比较了水-甲醇、水-乙腈、甲酸溶液-甲醇、甲酸溶液-乙腈4 种流动相体系，结果表明以甲酸溶液-乙腈作为流动相体系，4 种真菌毒素的离子信号值增强，且峰形得到明显改善。确定流动相体系为甲酸溶液-乙腈后，进一步优化了甲酸的用量，实验表明甲酸加入量为0.1%时，出峰效果最佳。

采用流动注射泵连续进样方式进行质谱条件的优化，分别在ESI＋模式和ESI－模式下进行全扫描，确定腾毒素、链格孢酚甲基乙醚和链格孢酚在负离子模式下的灵敏度更高，确定3 种真菌毒素的母离子分别是m/z 413.32、m/z 271.02和m/z 257.02；橘青霉素在正离子模式下的灵敏度高于负离子模式，确定其母离子为m/z 250.7。通过对毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂温度、碰撞电压、碰撞压力等质谱参数的优化，每一种真菌毒素均产生多个子离子，并从中各筛选出丰度强、干扰小的两对离子对作为监测离子对，以丰度最强的离子对作为定量离子对（表1），图4为1 mg/L标准溶液中4 种真菌毒素的MRM子离子质谱图。

图4 腾毒素、链格孢酚、链格孢酚甲基乙醚和橘青霉素的MRM子离子质谱图Fig.4 Mass spectra of tentoxin, alternariol methyl ether, alternariol, and citrinin

2.3 方法的评价

2.3.1 线性关系和检出限

利用UPLC-ESI-MS-MS测定复杂基质样品时，基质效应会影响方法的准确性，降低方法的灵敏度[23]。基质空白标准工作溶液使得标准溶液和样品溶液的离子化条件相同，从而减弱基质效应，因此采用基质空白标准工作溶液制作标准曲线。如表2所示，腾毒素、链格孢酚甲基乙醚、链格孢酚和橘青霉素均在5.0～200 μg/L范围内具有良好的线性关系，R2不小于0.992 7。以3 倍信噪比（RSN）计，腾毒素、链格孢酚甲基乙醚、链格孢酚和橘青霉素的检出限均低于0.2～0.7 μg/kg。

表2 4 种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数（R2）和检出限Table2 Liner ranges, linear equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LODs) for four mycotoxins

2.3.2 加标回收率和精密度

按1.2.2节方法分别制备果皮、果肉和全果样品，添加10、50、100 μg/kg 3 个水平的4 种真菌毒素，每个添加水平重复测定5 次。4 种目标物质在3 个加标水平的平均回收率为78.0%～103.3%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.6%～10.6%（表3），具有较高的回收率和精密度。

表3 柑橘果皮、果肉以及全果中4 种真菌毒素的添加回收率和精密度（n=5）Table3 Recovery rates and precision for four spiked mycotoxins in citrus peel, pulp and whole fruits (n=5)

2.3.3 实际样品测定

从冷库贮藏果中抽取100 个柑橘样品，按1.2.2节方法分别制备果皮、果肉和全果，UPLC-MS-MS分析（图5）。由表4可知，15 份柑橘果皮样品呈阳性，4 种真菌毒素含量在1.0～26.6 μg/kg之间，检出率在5.0%～11.0%之间；7 份全果样品呈阳性，4 种真菌毒素的含量在1.5～8.3 μg/kg之间，检出率在1.0%～5.0%之间；3 份果肉样品被检测出链格孢酚甲基乙醚，含量在2.5～6.0 μg/kg之间，其他3 种真菌毒素均未被检出。

图5 柑橘果肉（a）、全果（b）和果皮（c）实际样品的总离子色谱图Fig.5 Total ion chromatograms of citrus pulp (a), whole fruit (b) and peel (c)

表4 实际样品的检测结果Table4 Contents of four mycotoxins in real samples

3 结 论

本实验建立了UPLC-ESI-MS-MS结合改进的QuEChERS方法快速测定柑橘中腾毒素、链格孢酚甲基乙醚、链格孢酚和橘青霉素4 种真菌毒素的方法，方法快速、灵敏、准确，检出限低，重复性好，能够在8 min内完成检测。利用该方法检测柑橘中的4 种真菌毒素，平均回收率为78.0%～103.3%，相对标准偏差为2.6%～10.6%，符合真菌毒素检测的要求，适用于柑橘类样品的快速确证检测。

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Simultaneous Determination of Four Mycotoxins in Citrus Fruits by Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry Combined with Modified QuEChERS

SHI Wen-jing1,2, ZHAO Qi-yang1, JIAO Bi-ning1,2,3,*
(1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Citrus Products, Ministry of Agriculture, Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China; 2. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. National Citrus Engineering Research Center, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China)

A method was developed for simultaneous determination of four mycotoxins (aletrnariol monomethyl ether, tentoxin, alternariol, and citrinin) in citrus fruits using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with optimized QuEChERS. Samples were extracted with acetonitrile, salted out with anhydrous MgSO4and NaCl, cleaned up with C18and then analyzed using UPLC-MS-MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode with electrospray ionization. The separation of the target mycotoxins was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18liquid chromatography column through gradient elution using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution and the matrix-matched external standard calibration was used for quantitation. This method had a good linearity in the concentration range of 5.0-200 μg/L with correlation coefficients (R2) more than 0.992 7, and the limit of detection of the established method was in the range of 0.2-0.7 μg/kg. The average recoveries of the four mycotoxins in different matrixes (citrus pulp, peel and whole fruit) at three spiked levels ranged from 78.0% to 103.3%, with relative standard deviations (RSDs) of 2.6%-10.6%. This method is simple, quick, accurate, sensitive, and suitable for the quick confirmation and quantitative determination of the four mycotoxins in citrus fruits.

ultra-high liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; QuEChERS; citrus; mycotoxins

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0170-05

10.7506/spkx1002-6630-201420034

2013-11-11

国家现代农业（柑桔）产业技术体系建设专项（CARS-27）；“十一五”国家科技支撑计划项目（2007BAD47B07；2007BADB7B04）；2014年国家柑桔产品质量安全风险评估项目（GJFP2014003）；农业部无公害农产品质量安全监测项目

史文景（1989—），男，硕士研究生，研究方向为果品营养与安全。E-mail：shiwenjing001@126.com

*通信作者：焦必宁（1964—），男，研究员，本科，研究方向为果蔬质量安全及检测技术。E-mail：bljiao@tom.com