奶粉中游离氨基酸的提取工艺参数优化及同时测定

加列西·马那甫，德娜·吐热汗，李俊芳

（1.新疆农业大学化学工程学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学数理学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

奶粉中游离氨基酸的提取工艺参数优化及同时测定

加列西·马那甫1，德娜·吐热汗2，李俊芳1

（1.新疆农业大学化学工程学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学数理学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

根据单因素试验与响应面分析法中的Box-Behnken试验设计原理对影响奶粉游离氨基酸提取量的料液比、硫酸锌质量分数和离心时间3 个因素进行优化，并采用偏最小二乘法对以上游离氨基酸的模拟混合试样进行同时测定。结果表明，奶粉游离氨基酸的最佳提取条件为料液比1∶3.02（g/mL）、沉淀剂中硫酸锌质量分数10.23%、离心时间6.79 min，在此条件下，提取量为170 μg/g。硫酸铜与甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸反应生成的络合物，由于吸收光谱重叠严重，用光度法难以对单一组分进行同时测定。偏最小二乘法对游离氨基酸的模拟混合试样进行同时测定的结果显示，回收率98.2%～99.2%；相对预报误差为1.7%～2.9%。

奶粉；游离氨基酸；响应面分析法；提取；偏最小二乘法；同时测定

牛奶中的游离氨基酸对人体疾病的康复和预防起着重要的保健作用，对牛奶的鲜度、滋味、色泽有较明显的影响，是形成乳制品香气和鲜爽度的重要成分；其主要以甘氨酸、谷氨酸的形式存在，且含量一定；而有些氨基酸在人体内不能被合成，必须从食品或药品中得到。为了提高蛋白质的含量或改善牛奶的口感，在乳制品中添加单一的氨基酸而造成产品质量不合格的现象时有发生，因此对乳制品游离氨基酸的提取和分析测定是非常必要的[1-4]。

食品中氨基酸的分析方法主要有滴定法、毛细管电泳、色谱法、氨基酸测定仪、光度法等[5-15]。滴定法只能测定总氨基酸含量；色谱法和氨基酸测定仪具有选择性好、灵敏度高等特点，但对于多组分存在使用仪器、试剂昂贵且有污染等问题；光度法作为一种传统的分析方法，具有操作简便快速、费用低等优点，但对于多组分的同时测定，由于组分间吸收光谱重叠，无法对单一组分进行同时测定。响应面法结合偏最小二乘-光度法提取、同时测定奶粉游离氨基酸的含量尚未见报道。本研究在单因素试验的基础上采用响应面法优化奶粉游离氨基酸的提取工艺，偏最小二乘（partial least squares，PLS）法对光谱重叠的甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸4组分的模拟样品进行同时测定，并建立食品游离氨基酸多组分同时定量分析的多元校正方法[5,16-18]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

袋装奶粉购于乌鲁木齐市超市。甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、硫酸锌、亚铁氰化钾、氨水、乙醇、苏丹红l号、乙醚、石油醚、硫酸铜均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TV-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；AL204-IC型电子分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；WC/09-05恒温水浴槽 上海苏进仪器设备厂。

1.3 方法

1.3.1 模拟试样测定

精取适量20 mg/mL甘氨酸、8 mg/mL谷氨酸、12 mg/mL缬氨酸和4 mg/mL苯丙氨酸标准溶液于10.00 mL容量瓶中，加4.5 mL 0.1 mol/L硫酸铜溶液，加水定容至刻度，摇匀，配制成各单组分或4组分混合溶液，在600～900 nm波长范围，间隔1 nm对各单组分进行光谱扫描，得到吸收光谱图，并在此波长范围读取各单组分或4 组分混合溶液的吸光度。测定结果用PLS处理。

1.3.2 样品游离氨基酸的提取

精称5.000 g奶粉样品，置于100.0 mL容量瓶中，分别加入质量分数10%硫酸锌和10%亚铁氰化钾溶液各10 mL，摇匀，定容至刻度，静置沉淀，离心10 min，过滤。

1.3.3 样品游离氨基酸含量测定

精取样品滤液10.00 mL，移入具塞量筒中，加2 mL氨水，60 ℃水浴加热5 min，冷却至室温，加10 mL体积分数95%乙醇，移入分液漏斗中，加质量分数0.2%苏丹红l号溶液2 滴，摇匀，分别加入25 mL无水乙醚和石油醚，振摇30 s，敞开静置30 min，分取下层溶液，重复上述操作两次。分取液置于50 mL烧杯中，于80 ℃水浴加热除去氨水和乙醇、乙醚、石油醚。移至50.00 mL容量瓶中，加水定容至刻度。精取4 mL，于10.00 mL容量瓶中加4.5 mL硫酸铜溶液，加水稀释至刻度。在600～850 nm波长范围间隔1 nm测定吸光度A，计算游离氨基酸含量。

1.3.4 单因素试验

以市售袋装奶粉为原料，研究料液比、沉淀剂中硫酸锌质量分数（亚铁氰化钾质量分数固定为10%）和离心时间3 个因素对奶粉游离氨基酸提取量的影响。

1.3.5 响应面法优化奶粉游离氨基酸提取条件

根据Box-Behnken试验设计原理，采用响应面法，在三因素三水平上对奶粉游离氨基酸的提取条件进行优化。以料液比（A）、硫酸锌质量分数（B）和离心时间（C）3 个因素为自变量，游离氨基酸提取量（Y）为响应值，设计三因素三水平的试验。试验设计见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平表Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对游离氨基酸提取量的影响

保持硫酸锌质量分数10%和离心时间10 min不变，料液比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g/mL）时，考察奶粉游离氨基酸提取量的变化。

图1 料液比对奶粉游离氨基酸提取量的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of free amino acids

图1结果表明，随着液体含量的增加，提取量逐渐升高，料液比达到1∶3时提取效果最佳，但当液体含量继续增加时提取量有所下降。由于用干燥材料实验时材料吸水量大，料液比在1∶3之前，提取液被材料所吸收，不易过滤分离，从提取量及节约成本等方面考虑，料液比以1∶3为宜。

2.1.2 硫酸锌质量分数对游离氨基酸提取量的影响

保持料液比、离心时间和亚铁氰化钾质量分数不变，硫酸锌质量分数为5%、7.5%、10%、12.5%和15%时，考察其对奶粉游离氨基酸提取量的影响。

图2结果表明，随着硫酸锌质量分数的增加，提取量逐渐升高，硫酸锌质量分数达到10%提取效果最佳，但当硫酸锌质量分数继续增加时提取量有所下降趋势。这是由于沉淀剂中硫酸锌质量分数达到10%时，样品所含有的蛋白质彻底被沉淀，游离氨基酸的提取量最高，因此选择10%为最佳硫酸锌质量分数。

图2 沉淀剂中硫酸锌质量分数对游离氨基酸提取量的影响Fig.2 Effect of zinc sulfate concentration on the extraction efficiency of free amino acids

2.1.3 离心时间对游离氨基酸提取量的影响

保持其他条件不变，离心时间分别为2、5、10、15、20 min时，考察奶粉游离氨基酸提取量的变化。

图3 离心时间对游离氨基酸提取量的影响Fig.3 Effect of centrifugation time on the extraction efficiency of free amino acids

从图3可看出，随着离心时间的延长，提取液与蛋白质沉淀的分层更彻底，紧接着游离氨基酸的提取量也呈增加趋势，在离心10 min以后，蛋白质沉淀彻底，提取液澄清。考虑到提取效率等因素，离心时间选择在10 min为宜。

2.2 奶粉游离氨基酸提取工艺参数优化

2.2.1 响应面试验结果

响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面分析方案及试验结果Table2 Response surface design arrangement and experimental results

2.2.2 模型的建立与方差分析

根据Box-Behnken试验设计原理，利用SAS 9.1.3软件，对表2中的试验数据进行多元回归拟合，可得料液比（A）、硫酸锌质量分数（B）和离心时间（C）与奶粉游离氨基酸提取量的二次多元回归方程为：

Y=120.250 00＋16.375 00A＋1.250 00B＋1.825 00C－0.050 000AB＋0.050 000AC－0.020 000BC－1.875 00A2－0.021 250B2－0.075 000C2

对表2中的试验结果进行统计分析，得到的方差分析结果如表3所示。

表3 回归模型的方差分析表Table3 Analysis of variance for the regression model

由表3方差分析可知，方程模型F值为92.37%，P＜0.05，表明回归模型显著；失拟项F值为0.75，P值为0.614 8＞0.05，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的，说明该回归方程对试验拟合情况较好。各因素中一次项A显著；二次项中B极显著，A、C显著；交互项不显著。由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

图4 各因素交互作用的响应面图Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of operating parameters on the extraction efficiency of free amino acids

为了观察某两个因素及其交互作用同时对提取量的影响，将其他因素条件保持不变，获得某两个因素及其交互作用对提取量影响的响应面图，从而确定因素的最佳水平范围；响应面坡度的平缓与陡峭程度，表明在处理条件发生变异时奶粉游离氨基酸提取量的响应灵敏程度。由图4可知，奶粉游离氨基酸的提取中料液比与硫酸锌质量分数、料液比与离心时间、硫酸锌质量分数与离心时间的交互作用不显著，与表3中交互项P值的分析结果一致。

2.2.3 最佳提取条件的确定

通过软件SAS 9.1.3求解方程，得到奶粉游离氨基酸的最佳提取条件为料液比 1∶3.02（g/mL）、硫酸锌质量分数10.23%、离心时间6.79 min；对应的理论提取量响应值为170 μg/g。该回归方程与实际情况很吻合，说明响应面优化奶粉游离氨基酸的提取条件是可行的。

2.3 吸收光谱

图5 吸收光谱图Fig.5 Absorption spectra

由图5可见，不同氨基酸的吸收光谱谱带较复杂，最大吸收波长较接近，且相互重叠。经典的光度法以最大吸收点来解析数据，不能解决吸收光谱重叠严重的多组分同时测定问题。在一定波长范围利用化学计量学方法，建立其数学模型，才能确定氨基酸质量浓度与光谱间的关系[19-21]。

2.4 最佳计算测定条件的确定

2.4.1 吸光度加和性的考察

按1.3.1节配制4 份不同质量浓度的甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸标准模拟混合试样和相应质量浓度的各纯标准溶液，在选定的波长处测定吸光度，比较混合体系吸光度A与4 组分纯溶液的吸光度加合A0。实验结果表明，体系的|A－A0|∕A0均大于0.1，体系吸光度的加和性不好。如果体系的吸光度加和性好，体系不能用多元校正法同时测定多组分混合物，因为最佳吸收光谱区域在同一个波长范围。如果没有加和性，说明体系的吸收光谱相互没有干扰，单独可以测定每一个化合物。

2.4.2 波长范围及间隔的确定

波长范围及间隔的选择是建立模型和进行计算的关键步骤[22-23]。为了检查波长范围对计算结果的影响，根据吸收曲线，在相同的波长间隔、不同的波长选择范围，对同一套模拟混合试样进行PLS计算，计算结果可知，对于此类模拟混合体系，波长范围的选择对计算结果产生严重影响，选择波长600～850 nm为最佳。在保证准确度前提下，选择2 nm的间隔为宜。

2.4.3 模拟混合试样的测定

按正交设计表L9（34）配制9 组不同质量浓度的4组分模拟混合试样作校正组（表4），建立校正模型，测定不同波长处的吸光度。对另一9 组不同质量浓度4组分模拟混合试样预报组进行测定，用PLS进行数据处理，结果见表5。

表4 模拟混合样品校正组质量浓度组成Table4 Composition of mixed free amino acids in calibration set

表5 模拟混合样品预报组质量浓度组成、PLS预测值及误差分析Table5 Composition, PLS prediction values and error analysis of mixed free amino acids in prediction set

2.5 市售袋装奶粉中游离氨基酸测定结果

表6 样品测定结果（n=3）Table6 Results obtained for determination of free amino acids in real samples（n=3）

为了避免在乳制品中添加单一氨基酸而造成产品质量不合格的现象，采用PLS对单一氨基酸进行同时测定；如表6所示，市售袋装奶粉中，甘氨酸含量35 μg/g、谷氨酸含量140 μg/g、缬氨酸含量0.3 μg/g、苯丙氨酸含量0。

3 结 论

游离氨基酸含量是判定乳制品卫生质量的重要指标之一，特别是近几年掺杂单一氨基酸而造成产品质量不合格的现象时有发生，检测此项目尤为重要。本研究使用硫酸锌、亚铁氰化钾较好地解决了样品中蛋白质、脂肪等物质的沉淀问题，避免了维生素、氯化物和碘化物等阴离子成分的干扰。与正交试验相比，响应面法在试验条件寻优过程中，可以对各水平进行分析，研究试验因素间的交互作用，求得高精密度的回归方程，具有设计简单、精确度高等优点。在单因素试验的基础上，将响应面法应用于优化奶粉游离氨基酸的提取工艺，通过拟合方程得到的最佳提取条件为料液比1∶3.02（g/mL）、硫酸锌质量分数10.23%、离心时间6.79 min，在此条件下，提取量为170 μg/g。由于生成的氨基酸络合物吸收光谱重叠，难以分离，无法对单一组分进行同时测定，采用PLS不仅解决因重叠光谱造成测定某些物质选择性差而需进行繁琐的化学掩蔽和分离等问题，而且对质量浓度给出较准确的预测，减小测定误差。对食品游离氨基酸类多组分含量的同时测定提供新的研究手段，具有一定的实用价值。

[1] 加列西·马那甫, 高珍珍, 德娜·吐热汗, 等. 可见光谱结合偏最小二乘法对牛奶游离氨基酸的同时测定[J]. 计算机与应用化学, 2012, 29(12): 1475-1477.

[2] 钟秋瓒. 乳饮料及乳制品中游离甘氨酸的测定[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(2): 159-161.

[3] 赖玉婷, 董芷呈, 陈挺强, 等. 基于氨基酸模式的牛奶蛋白掺假分析[J].食品工业科技, 2013, 34(6): 82-84.

[4] 王定坤, 冯志强, 文灿, 等. 全脂奶粉中蛋白质和氨基酸组成的比较研究[J]. 现代食品科技, 2012, 28(12): 1803-1805.

[5] 刘荣森, 杨虹琦, 黄郁维, 等. 植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法[J]. 河南科技大学学报: 自然科学版, 2007, 28(3): 765-769.

[6] 田志梅. 甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋白质含量[J]. 中国食品卫生杂志, 2008, 20(3): 244-245.

[7] 冯海清, 傅崇岗. 毛细管电泳电化学检测法同时测定三种氨基酸的电离常数[J]. 分析试验室, 2006, 25(8): 21-23.

[8] 田兰, 陈春丽, 马晓丽, 等. 毛细管电泳法对乳及乳制品中乳源蛋白的测定[J]. 食品研究与开发, 2013, 34(4): 81-84.

[9] 尹东光, 吴明红, 谢春娟, 等. 新型毛细管电泳化学发光系统应用于氨基酸分离测定[J]. 分析化学, 2013, 34(4): 152-156.

[10] 刘青青, 贾丽. 毛细管电泳技术在氨基酸分析中的研究进展[J]. 分析测试学报, 2009, 28(1): 123-128.

[11] 连莹, 仲平. 水解蛋白注射液中游离氨基酸含量的测定及分析[J].药物分析杂志, 2012, 32(1): 61-65.

[12] 王棘, 潘雪妍, 杨宏伟. HPLC法和氨基酸分析仪(AAA)法测定肠外营养注射液(25)中18种氨基酸的含量的比较[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(6): 1085-1089.

[13] 裴玉, 肖雪, 付婵, 等. 柱前衍生化HPLC法测定丹红注射液氨基酸[J].中成药, 2012, 34(9): 1703-1707.

[14] 王培培, 鲁芹飞, 李婧, 等. 铁皮石斛中总氨基酸的含量测定及提取工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(14): 30-33.

[15] 吴红梅, 李晨晨, 刘楠, 等. 闪式与回流提取美洲大蠊总氨基酸的工艺比较[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(21): 52-53.

[16] 赵希贤, 杨抒宁, 彭澍. 珍珠母水解提取氨基酸工艺的初步研究[J].北京中医药大学学报, 2005, 28(5): 54-55.

[17] 杜一平, 潘铁英, 张玉兰. 化学计量学应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2008: 159-163.

[18] 薛敏, 高贵田, 赵金梅, 等. 不同品种猕猴桃果实游离氨基酸主成分分析与综合评价[J]. 食品工业科技, 2014, 35(5): 294-297.

[19] 于洪梅, 王志有, 李井会, 等. 偏最小二乘法-BP神经网络光度法同时测定复方氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[J]. 理化检验: 化学分册, 2008, 44(5): 411-412.

[20] 加列西·马那甫, 杨晓君. PLS-UV法同时测定谷丙甘氨酸胶囊中的3 种氨基酸[J]. 华西药学杂志, 2013, 28(5): 526-528.

[21] 王雁鹏, 董旭辉, 陈岩, 等. 卡尔曼滤波分光光度法同时测定混合氨基酸[J]. 光谱实验室, 2006, 23(6): 1166-1169.

[22] 粟晖, 黎国梁, 姚志湘, 等. 紫外光谱法对维生素E油酸酯、维生素E与油酸的同时测定[J]. 分析测试学报, 2009, 28(11): 1314-1317.

[23] 卢新生, 张海玲, 苟如虎, 等. 紫外可见分光光度法同时测定水中铬(Ⅵ)和锰(Ⅶ)的含量[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(10): 6025-6026.

Optimization of Extraction Parameters and Simultaneous Determination of Free Amino Acids in Milk Powder

JIALIEXI Manafu1, DENA Turehan2, LI Jun-fang1
(1. College of Chemical Engineering, Xinjiang Agricultural University, Ürümqi 830052, China; 2. College of Mathematics and Physics, Xinjiang Agricultural University, Ürümqi 830052, China)

Three variables (operating parameters) affecting the extraction efficiency of free amino acids from milk powder, solid-to-solvent ratio, zinc sulfate concentration (for protein precipitation), and centrifugation time, were optimized by response surface analysis (RSA) based on a Box-Behnken design. Simultaneous determination of mixed free amino acids and free amino acids in milk powder samples was performed by visible spectrophotometry combined with partial least square (PLS). The results showed that under the optimal conditions: solid-to-solvent ratio, 1:3.02 (g/mL); zinc sulfate concentration, 10.23%; and centrifugation time, 6.79 min, the extraction yield was 170 μg/g. The complexation of copper sulfate with glycine, glutamic acid, valine and phenylalanine resulted in highly overlapping absorption spectra when mixed together, which made it difficult to simultaneously determine the individual components. The simultaneous determination of mixed free amino acids using PLS demonstrated that the recovery rate was 98.2%-99.2% and the relative prediction error (RPE) was 1.7%-2.9%.

milk power; free amino acids; response surface analysis; extraction; partial least squares; simultaneous determination

TS201.1

A

1002-6630（2014）20-0093-05

10.7506/spkx1002-6630-201420019

2014-01-13

加列西·马那甫（1964—），男，副教授，学士，研究方向为实用药物分析。E-mail：jialiexi@sina.cn