索拉非尼对肝癌患者血清中肿瘤相关miRNAs的影响

成炳祥 方 煊 朱承良 秦运升 庄 莉

1.浙江省绍兴第二医院外科，浙江绍兴 312000；2.浙江大学医学院附属第一医院肝胆外科，浙江杭州 310003

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其进展迅速，对放化疗不敏感，手术切除后易转移复发，因而在我国恶性肿瘤的病死率中，肝癌占第2 位[1]。索拉菲尼是一种新型的口服多激酶抑制剂，其通过对Raf/丝裂原活性蛋白激酶/细胞外信号转导通路（Raf/MEK/ERK）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）-1，2，3 等通路的抑制调控，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖和阻断肿瘤新生血管形成的双重抗肿瘤作用[2-3]。 目前临床研究证实，索拉非尼的使用可以有效提高肝癌患者的生存时间[4-5]。miRNA 是近年来发现的一类广泛存在于人体中，不编码蛋白质的短序列RNA（20～25 nt），在细胞生长和凋亡、干细胞分化、胚胎后期发育过程中发挥着重要的调控作用[6-7]。 值得关注的是，miRNAs 表达谱和表达水平在肝癌肿瘤组织和患者血清中均出现较明显的变化，提示miRNA 对于肝癌的发生和发展中起着非常重要的作用[8]。本研究采用miRNA 芯片技术检测索拉菲尼治疗前后对肝癌患者血清中肿瘤相关miRNA 表达谱改变情况，为进一步研究索拉菲尼治疗肝癌的机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011 年10 月～2012 年9 月在绍兴第二医院及浙江大学医学院附属第一医院接受治疗的6 例肝癌患者的血清样本。所有患者均经组织病理学检测证实为肝细胞肝癌，诊断均符合2001 年肝癌临床诊断标准和临床分期。所选病例应同时满足以下条件：不适合手术治疗，体力状况ECOG 评分≤2 分，Child-Pugh评分A、B 级，预计生存时间>12 周，血小板（PLT）≥60×109/L，血红蛋白（Hb）≥85 g/L，谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）≤正常值上限3 倍以内。本组研究对象中男4 例，女2 例，平均年龄（52.6±14.8）岁；肿瘤直径8.7～15.4 cm；病灶数目1～3 个，其中单发2 例、多发4 例；甲胎蛋白（AFP）平均值（837.42±178.75）ng/mL。

1.2 主要试剂和仪器

mirVanaTMmiRNA Isolation Kit （Ambion 公司，美国）；miScript Reverse Transcription Kit （Qiagen 公司，德国）；SYBR Green I（10000×）和PlatinumTaq DNA聚合酶（Invitrogen 公司，美国）；MMLV 反转录酶和RNA 酶抑制剂（epicentre 公司，美国）；miRNA 芯片由丹麦Exiqon 公司制作，上海康成生物工程有限公司代理；DU-730 紫外分光光度计和PRISM 7900 实时荧光定量PCR 仪（ABI 公司，美国）；miR-122 及U6 引物序列由阅微基因技术有限公司合成。

1.3 药物干预

索拉非尼（商品名：多吉美，拜耳公司；批号：H20060296）采用统一的给药方式，400 mg/次，2 次/d，口服，服药前禁食2 h。比较患者服药前和服药1 个月后各项指标。

1.4 血清样本的收集

所有患者服药前和服药1 个月后空腹采集外周静脉血5 mL，室温下静置60 min。然后在4℃，3000 r/min条件下离心15 min，取上清（血清）保存于-80°C 冰箱待下一步实验。

1.5 miRNA 表达谱芯片检测

①总RNA 和miRNA 的提取按照mirVanaTMmiRNA Isolation Kit 和mirVanaTMRNA Isolation Kit 说明书步骤进行操作。 DU-730 紫外分光光度计进行RNA 定量，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。 ②制备荧光标记探针：采用miRCURYTM Array Power 标记试剂盒，用标记酶将Hy3TM：荧光基团标记miRNA 制备荧光标记探针。 ③miRNA 芯片杂交、图像扫描和数据分析：在标准条件下将制备好的荧光标记探针和miRCURYTM芯片放入PhalanxTM的热收缩杂交袋进行杂交。 使用GenePix 4000B 芯片扫描仪对杂交好的芯片进行扫描并收集荧光强度信号，图像生成后使用Genepix Pro 6.0 软件对原始数据进行分析运算，并将实验结果转换成数字型数据保存。芯片实验数据分析软件MeV4.0 对数据进行聚类分析，计算两种检测信号的比值（log2）。

1.6 Real time RT-PCR 验证

基于芯片结果对miR-122 进行验证。采用stem-loop进行miRNA 逆转录。 反应条件如下：16℃，30 min；42℃，40 min；85°C，5 min。 采用Sybergreen Ⅰ方法进行Realtime PCR 反应。 按以下程序进行扩增：95℃，10 min；40 个PCR 循环（95℃，15 s；60℃，60 s），扩增反应结束后继续从72°C 缓慢加热到99℃以建立PCR产物的熔解曲线（每5 秒升高1℃），实验重复3 次，以U6 snRNA 作为内参，数据采用2-ΔΔCT法对miR-122的表达进行分析。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0 对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两独立样本的计量资料采用t 检验。 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA 表达谱差异情况

所有血清样本中提取的RNA，通过紫外定量和琼脂糖凝胶电泳分析显示RNA 完整性较好， 质量符合要求芯片检测的要求。 miRNA 芯片内置约1700 个miRNA 捕获探针，通过应用SAM 软件分析miRNA 表达谱芯片，结果显示，同治疗前相比，服用索拉非尼1个月后肝癌患者血清miRNA 表达谱中存在16 个明显上调的miRNAs 和10 个明显下调的miRNAs；特别是miR-122，其表达上升幅度大于10 倍。 见表1。

2.2 Real-time RT-PCR 验证miR-122

以U6 snRNA 为内参，通过Real-time RT-PCR检测索拉非尼治疗前后肝癌患者血清中的miR-122表达水平的差异。 结果显示，治疗前肝癌患者血清miR-122 相对表达值为（1.07±0.32），索拉非尼治疗1个月后肝癌患者血清中的miR-122 相对表达值为（9.10±1.89），较治疗前表达水平显著上调，差异有统计学意义（P < 0.05），与芯片的结果一致。 见图1。

表1 索拉菲尼治疗前后肝癌患者血清中miRNAs 表达改变

图1 RT-PCR 检测miR-122 在索拉菲尼治疗前后肝癌患者血清中的表达

3 讨论

索拉非尼是拜耳公司和ONYX 公司共同研制的一种小分子多靶点的生物靶向治疗新药。 2005 年首次被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗晚期肾细胞癌。此后，临床研究发现，索拉非尼可以显著提高晚期肝癌患者的生存时间[9]。因此，索拉非尼已被FDA 和我国原国家食品药品监督管理局（SFDA）批准为治疗晚期肝细胞癌唯一有效的分子靶向药[4]。

索拉非尼治疗恶性肿瘤的作用机制复杂，主要通过作用于多靶点实现抑制肿瘤增殖及新血管形成，从而达到杀伤肿瘤的目的。 主要包括：抑制位于肿瘤血管生成信号转导路径的上游及肿瘤细胞信号转导路径的上游的Raf/丝裂原活性蛋白激酶/细胞外信号转导通路（Raf/MEK/ERK）；抑制人VEGFR-1，2，3、血小板衍生生长因子受体 （PDGFR）-β、FMS 样酪氨酸激酶3（FLT3）和c-Kit 原癌基因的酪氨酸激酶活性；抑制Mcl-1 基因翻译，c-Kit 蛋白以及致癌性RET 受体酪氨酸激酶等[10-11]。然而，索拉非尼抗恶性肿瘤的作用机制尚未完全阐明。

miRNA 是新近发现的一类广泛影响/调节机体内的各种细胞生物学过程和调节途径的小RNA 分子。大量的研究证实，miRNA 在恶性肿瘤的发生、发展和转归中起着非常重要的作用[12]，恶性肿瘤患者肿瘤组织和血清中miRNAs 的表达往往是失调的，且这种异常改变与肿瘤的形成、生长、复发、转移以及预后是密切相关的[8，13]。

miR-122 是目前证实的在肝细胞中特异性高表达的一种miRNA，其前体定位于人类18 号染色体18q21.31 上，是来源于hcr 基因转录本且肝脏中特异性高表达的一种miRNA。 生理状态下，miR-122 在调控肝脏的细胞发育、调节细胞代谢和诱导细胞分化等生命活动过程中发挥重要作用[14]。研究显示，miR-122与肝癌的发生、发展及转移密切相关。 肝癌细胞中miR-122 的表达明显下调，其在肝癌的发生发展中表现出抑癌基因的功能。 Cyclin G1、Wnt1、β-catenin、Igf1R、ADAM-17、TCF-4 和Bcl-w 等致癌基因被证实为miR-122 的下游靶基因[15]。此外，有研究表明，人为上调肝癌细胞中miR-122 的表达可以提高肿瘤细胞对索拉非尼的敏感性[16-17]。

本次实验采用的是基于LNATM 技术捕获探针的miRNA 芯片来检测索拉非尼治疗前后对肝癌患者血清中肿瘤相关miRNA 表达谱改变情况。 将表达丰度改变≥2 倍作为筛选差异显著miRNA 的评定标准。结果显示，同治疗前相比，服用索拉非尼1 月后肝癌患者血清miRNA 表达谱中存在16 个明显上调的miRNAs 和10 个明显下调的miRNAs；特别是miR-122，其表达上升幅度大于10 倍。 Real time PCR进一步验证miR-122，结果显示与芯片结果一致，提示miR-122 可能参与索拉非尼对肝癌的治疗，但是具体的机制还需要进一步研究。

综上所述，本次研究结果显示，索拉非尼治疗能导致肝癌患者血清中肿瘤相关miRNA 表达谱发生明显改变。 提示索拉非尼对肝癌相关miRNAs 的调控可能是索拉非尼治疗肝癌的重要机制之一。通过人工上调相关miRNAs（如miR-122）的表达，可能增强索拉非尼对肝癌的疗效，这对于晚期肝癌的非手术治疗将有很大应用价值。

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