红酒中添加红色素的快速检测

杜建中，陈 婷，刘木球，梁 容，陈李燕

（湛江师范学院化学科学与技术学院，广东 湛江 524048）

红酒中添加红色素的快速检测

杜建中，陈 婷，刘木球，梁 容，陈李燕

（湛江师范学院化学科学与技术学院，广东 湛江 524048）

根据红酒中花青素的化学性质以及常用红色素的特点，制备醋酸铅试纸，用于红酒中添加红色素的快速检测，本方法简便、快速、成本耗费低。同时建立毛细管电泳法分离测定假红酒中诱惑红、胭脂红和苋菜红的方法。考察缓冲溶液种类、缓冲溶液浓度、pH值、分离电压对分离测定的影响。在波长215 nm、分离电压15 kV、10 mmol/L NaH2PO4缓冲溶液（pH 11）中，诱惑红、胭脂红、苋菜红在6 min内可得到较好地分离。

红酒；醋酸铅试纸；合成色素；毛细管电泳

红酒是以葡萄为原料酿制的饮料酒，它富含多糖、有机酸、多酚、无机盐、微量元素、含氮物质及多种氨基酸和维生素。研究表明长期适量饮用红酒可以降低癌症的发病率、心脑血管引起的死亡率，延缓衰老，对身体健康大有益处[1]。红酒中原花青素具有极强的抗氧化性，具有清除自由基、提高血管抵抗力、降低毛细血管渗透性的功效[2]。

近年来，随着人们生活水平的提高，我国红酒消费快速增长。市场上有些不法商家为了谋取暴利，在劣质红酒中添加胭脂红、苋菜红等色素，使产品外观近似天然红葡萄酒，以达到欺骗消费者的目的。更有甚者利用化学试剂和合成色素直接勾兑假红酒，对消费者身心健康产生严重的危害。合成色素是指人工化学合成的有机色素，因色泽鲜艳、稳定性好、着色力强、适于调色、易于溶解、品质均一、无臭无味、成本低廉等优点，被食品、药物、化妆品等生产厂家广泛使用。研究表明，合成色素对人体的健康有害[3]，主要包括一般毒性、致泻性和致癌性，表现为对人体直接危害或在代谢过程中产生有害物质及合成过程中带入的砷、铅等污染物的危害，合成色素的致癌性可能与其多为偶氮化合物有关[3]。为此GB 15037—2006《葡萄酒》规定所有葡萄酒产品中禁止使用合成色素[4]。

红酒中的主要色素成分是黄色素（黄酮类物质）和红色素（花青素）[5]，本研究根据花青素与醋酸铅反应生成蓝色沉淀，而常用合成红色素不具有上述性质的的特点，制备了醋酸铅试纸，用于红酒中添加色素的定性检测。

人工合成色素的定量检测方法有双波长分光光度法[6]、偏最小二乘变量筛选法[7]、微机极谱法[8]、高效液相色谱法[9-10]、示波极谱法[11]、高效液相色谱-质谱联用法[12]、反相高效液相色谱[13]、紫外分光光度法[14]、高效液相色谱-变换波长法[15]、超高效液相色谱法[16]、荧光光谱法[17]、导数荧光光谱法[18]、磁性分离富集-分光光度法[19]等。而对红酒中合成色素测定报道较少[20-23]。结合毛细管电泳高效、快速、微量、费用低等特点，本研究采用毛细管电泳法对红酒中的人工合成色素（诱惑红、胭脂红、苋菜红）进行定量测定，旨在对醋酸铅试纸快速检测结果进一步确认。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1#长城干红葡萄酒、2#长城干红葡萄酒、3#解百纳高级红葡萄酒、5#长城星级干红葡萄酒、6#赤霞珠精品红葡萄酒、7#赤霞珠干红葡萄酒、8#长城干红葡萄酒，均购于农贸市场；4#赤霞珠干红葡萄酒、9#长城干红葡萄酒购于当地大型超市；10#castel红葡萄酒购于当地专卖店。

醋酸铅、桂皮酸 广东光华化学厂有限公司；磷酸二氢钠、硼砂 汕头市光华化学厂；胭脂红、诱惑红东京化成工业株式会社；苋菜红 上海三爱思试剂有限公司；所用试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DT-100电子天平 江苏常熟市双杰测试仪器厂；AY-120分析天平 日本岛津公司；CL2001高效毛细管电泳仪 北京彩陆科学仪器有限公司；未涂层熔融石英毛细管（管径100 μm，有效长度45 cm） 河北永年光导纤维厂；PHS-3C型酸度计 上海雷磁仪器厂；UV-2550型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸铅试纸的制备

移取25 mL 0.4 mol/L醋酸铅溶液于洁净的50 mL烧杯中，放入20 张滤纸条（1.5 cm×3 cm）至完全浸没。浸泡15 min后，用镊子将滤纸从溶液中取出，平摊于托盘中，放入烘箱烘干[24]，备用。

1.3.2 电泳条件

测定波长215 nm；阳极端手动压差进样；进样高度10 cm；进样时间6 s；分离电压15 kV；运行缓冲溶液为10 mmol/L磷酸二氢钠溶液（pH 11）。

新毛细管分别用1 mol/L HCl溶液冲洗10 min、蒸馏水冲洗5 min，再用1 mol/L NaOH溶液冲洗10 min，蒸馏水冲洗5 min，最后用运行缓冲溶液冲洗5 min。每一次进样前分别用蒸馏水和缓冲溶液来洗涤毛细管各2 min。

1.3.3 红酒中添加红色素的定性检测

取已制备好的醋酸铅试纸，用滴管将适量的待测红酒滴在试纸上，观察斑点颜色。以确定红酒中是否添加红色素。

1.3.4 红酒中合成色素的定量测定

分别准确称量0.019 0 g诱惑红、0.018 8 g胭脂红、0.015 1 g苋菜红于10 mL的容量瓶中，然后加入蒸馏水溶解、定容至10.00 mL、摇匀备用，其质量浓度分别为1.90、1.88、1.51 g/L。称取0.1 g桂皮酸加入100 mL水中，待溶解平衡后，取上清液得到室温条件下桂皮酸的饱和溶液。

准确移取一定体积诱惑红、胭脂红和苋菜红标准溶液混合，使其最终质量浓度分别为0.380、0.376 g/L和0.302 g/L。准确移取100 μL标准混合液、100 μL桂皮酸饱和溶液和200 μL蒸馏水于小试管中，配成400 μL标准溶液（A），另移取200 μL混合液和200 μL蒸馏水配成标准溶液的稀释液（B），准确移取100 μL B溶液、100 μL桂皮酸饱和溶液和200 μL蒸馏水配成质量浓度为A溶液的1/2的标准混合溶液，在加入等量桂皮酸，逐级稀释，配制成质量浓度分别为A溶液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128的系列标准溶液。在上述电泳条件下，依次测定系列标准溶液中各种色素的峰面积及桂皮酸的峰面积。分别以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，色素峰面积与桂皮酸峰面积比值为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，并计算线性方程。

准确移取200 μL红酒于小试管中，加入100 μL桂皮酸饱和溶液、100 μL蒸馏水，摇匀，在电泳条件下，测定诱惑红、胭脂红和苋菜红峰面积或3 种色素峰面积与桂皮酸的峰面积比值，代入线性方程，计算出假红酒中诱惑红、胭脂红、苋菜红的含量。

2 结果与分析

2.1 电泳条件的确定

2.1.1 测定波长的选择

测定诱惑红、胭脂红和苋菜红在200～600 nm波长范围的吸收曲线，见图1。结果表明，3 种合成色素在215 nm波长处有较大吸光度，故选择215 nm作为测定波长。

图1 3种合成色素的吸收曲线Fig.1 Absorption spectra of 3 kinds of synthetic red pigments

2.1.2 缓冲体系的选择

不同的缓冲体系的分离效果不同，在测定波长215 nm、分离电压15 kV、缓冲溶液pH 8条件下，考察了10 mmol/L硼砂缓冲体系、10 mmol/L磷酸二氢钠缓冲体系、5 mmol/L硼砂-5 mmol/L磷酸二氢钠混合缓冲体系对分离的影响。3 种缓冲体系中，磷酸二氢钠缓冲体系和硼砂-磷酸二氢钠混合体系分离效果相对较好，磷酸二氢钠体系组分简单，因此实验选择磷酸二氢钠体系。

2.1.3 缓冲溶液pH值的选择

毛细管的电渗流对于pH值的改变很敏感，且pH值对分离度以及峰形等参数有很大的影响，pH值还强烈地影响熔硅毛细管的表面特性[25]。在测定波长215 nm、分离电压15 kV、10 mmol/L NaH2PO4的条件下，考察了缓冲溶液的pH值对3 种色素分离情况的影响，见图2。缓冲溶液的pH值为11、12时，其分离效果均较好，而pH 11时分析时间短、峰面积较大，所以选择pH 11。

图2 缓冲溶液pH值对3 种合成色素分离效果的影响Fig.2 Effect of running buffer pH on separation of three kinds of synthetic pigments

2.1.4 缓冲溶液浓度的选择

缓冲溶液的浓度同样对分离效率、分离度以及分离时间有影响。在测定波长215 nm、分离电压15 kV、pH 11的NaH2PO4缓冲溶液条件下，改变NaH2PO4的浓度，考察浓度对3 种色素分离情况的影响，见图3。NaH2PO4浓度为10、15 mmol/L时分离效果均较好，考虑节约试剂，选择了10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液。

图3 缓冲溶液浓度对3 种合成色素分离效果的影响Fig.3 Effect of running buffer concentration on separation of three kinds of synthetic pigments

2.1.5 内标物的选择

内标物可以很好地定位峰的位置，还可以用内标物的峰面积与待测物峰面积的比值对浓度绘制工作曲线进行定量测定，以减少由于进样时间、进样高度的差异对测定结果带来的影响。在测定波长215 nm、分离电压15 kV、10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 11）的条件下，考察以尼泊金丙酯、桂皮酸为内标物的电泳情况，见图4。内标物与待测物质的出峰时间越接近，标定效果越好，因此实验选择桂皮酸为内标物。

图4 内标物的选择Fig.4 Selection of optimal internal standard

2.1.6 分离电压的选择

图5 分离电压对色素分离效果影响Fig.5 Effect of separation voltage on separation of three kinds of synthetic pigments

分离电压对于物质的分离有一定的影响，选择合适的分离电压，可以缩短分离时间。在测定波长215 nm、pH 11的10 mmol/L NaH2PO4缓冲溶液条件下，考察了分离电压为10、15、20 kV时，3 种色素的电泳情况，见图5。分离电压为15 kV时，3 种色素分离效果好，出峰时间合适，实验选择分离电压15 kV。

通过上述实验，确定电泳条件为：测定波长215 nm，分离电压15 kV，运行缓冲溶液为10 mmol/L的磷酸盐溶液（pH 11）。在优化的电泳条件下，诱惑红、柠檬黄和苋菜红在6 min内可得到基线分离。

2.2 标准曲线的绘制

在优化的分离条件下测定3种合成色素标准液及桂皮酸的峰面积，分别以质量浓度为横坐标、色素峰面积为纵坐标，或以色素峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准曲线（表1）。

表1 定量分析特征参数Table1 Characteristic parameters for quantitative analysis of pigments by capillary electrophoresis

2.3 红酒样品中合成色素的定性检测

用滴管分别将待测红酒样品滴在醋酸铅试纸上，观察斑点的颜色，结果见表2。

表2 红酒的定性分析结果Table2 Results for qualitative analysis of red wine

当醋酸铅试纸定性检测只出现墨绿色或暗绿色时，说明该红酒为葡萄发酵，未添加其他色素；出现红色，可判断为该红酒中人为添加了其他色素。1#、2#、4#、9#、10#5 种红酒在醋酸铅试纸上的斑点颜色为暗绿色或墨绿色，而非蓝色，其原因是花青素的蓝色与黄酮类物质的黄色混合，导致观察到的颜色为暗绿色或墨绿色，且红酒中花青素与黄酮类物质含量不同，在试纸上观察到的绿色也有所不同。上述5 种红酒在试纸均无红色出现，初步判断这5 种红酒中未添加其他色素；3#、5#、6#、7#、8#5 种红酒在醋酸铅试纸上的斑点都有红色出现，初步判断该红酒中添加了其他色素。

2.4 红酒样品的毛细管电泳分析

利用毛细管电泳法，在优化条件下对10种红酒进行了检测分析，结合加标法，以确定红酒中含有的色素，1#、2#、4#、9#、10#红酒未检测出添加人工合成色素，见图6。

图6 未检出合成色素的红酒电泳图Fig.6 Capillary electrophoresis of red wine with undetectable levels of synthetic pigments

通过毛细管电泳分析，3#、5#、6#、7#、8#红酒检测出添加了红色素，结果见图7。

图7 检出合成色素的红酒电泳图Fig.7 Capillary electrophoresis of fake red wine with detectable levels of added synthetic pigments

由图7可知，5#、6#、8#红酒样品中检测出苋菜红，7#红酒中检测出胭脂红，而3#红酒样品中添加了诱惑红、胭脂红和苋菜红以外的其他红色色素。3#、5#、6#红酒的电泳图与其他红酒样品电泳图相比，谱图简单，说明这3种红酒可能是用化学试剂勾兑而成。7#、8#红酒样品的电泳图与未添加色素红酒样品电泳图相比，有相似之处，说明这2种红酒可能是生产厂家为了提高红酒的色调，在劣质红酒中添加了合成色素。

黑米和黑桑椹也富含花青素，用乙醇和水从黑米和黑桑椹中提取花青素，取其浸出液分别用醋酸铅试纸检测，其现象与1#、2#、4#、9#、10#红酒在醋酸铅试纸上呈现的现象十分相似。由此可知，醋酸铅试纸无法检验红酒中是否添加了由其他富含花青素的物质中提取的天然色素。由1#、2#、4#、9#、10#红酒的电泳图谱可知，诱惑红的峰与红酒本身的峰产生了重叠，因此，在劣质红酒中加入诱惑红，用上述毛细管电泳法无法定量测定。但用化学试剂添加诱惑红制备的假酒，可用上述毛细管电泳法进行定量测定。

2.5 精密度

分别准确移取200 μL 8#红酒样品于5个微量试管中，分别加入100 μL桂皮酸溶液、100 μL蒸馏水，摇匀。在电泳条件下，每份样品测定5次取平均值，计算苋菜红的含量。5份测定结果的相对标准偏差为3.5%，说明本方法的精密度较好。

2.6 样品的测定

分别测定5#、6#、7#、8#号红酒中所含色素的峰面积或色素峰面积与内标物峰面积的比值，计算出所添加色素的含量，结果见表3。6#假红酒中苋菜红含量为8.0 mg/L，不足以使该假酒具有较红的颜色，结合其电泳图分析，6#红酒中除含苋菜红外，可能还含有与3#红酒相同的其他添加色素。

表3 样品测定结果（n=5）Table3 Contents of carmine and amaranth in four wine samples (n=5)

2.7 回收率

准确移取5份200 μL 8#红酒，加入桂皮酸溶液100 μL和100 μL苋菜红标准溶液于微量试管中，进行加标回收率实验，每份测定5次取平均值，结果见表4。

表4 回收率测定（n=5）Table4 Results of recovery experiments (n=5)

3 结 论

毛细管电泳具有高效、快速、微量、准确等特点，采用该方法对红酒中的人工合成色素（诱惑红、胭脂红、苋菜红）进行定量测定,取得了较好的效果，但由于使用仪器的限制，不易推广使用。醋酸铅试纸用于红酒中添加红色素的定性检测，方法操作简便、成本耗费低、结果可靠，适宜消费者在日常生活中使用。

利用醋酸铅试纸对10 瓶购买于不同市场的红酒进行了定性检测，其中5 瓶检测出添加了红色素，利用毛细管电泳法对10 瓶红酒进行了电泳分析，验证了醋酸铅试纸检测的结果。说明利用醋酸铅试纸检测红酒中是否添加色素是可行的。将该试纸在常温、密封的条件下保存3个月，试纸的检测效果未发生变化。但醋酸铅试纸不能检测出具体添加了何种合成色素。

本实验检测出添加合成色素的伪劣红酒，均购买于距离城市中心较远的农贸市场，而购买于大型超市和专卖店的红酒未检测出添加其他色素，结果说明农贸市场、城乡结合部的小门店是假酒、不合格酒较多的地方，也是各级质检部门应该重点关注的区域。

[1] 王惠芝, 孟桂芹, 米永亮. 红葡萄酒与人类健康[J]. 河北林业科技, 2007, 35(4): 44-45.

[2] 吴巍, 程秀凤. 葡萄酒中原花青素的测定[J]. 食品研究与开发, 2011, 32(1): 102-103.

[3] 于立青, 彭蜀晋. 食品色素和人体健康[J]. 化学教育, 2005, 26(6): 3-5.

[4] 国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB 15037—2006 葡萄酒[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007.

[5] 李华, 王华, 袁春龙. 葡萄酒化学[M]. 北京: 科学出版社, 2005: 107-110.

[6] 杜建中, 庞惠丹, 吴素琴, 等. 高聚物萃取双波长法测定胭脂红及苋菜红含量的研究[J]. 食品科学, 2008, 29(3): 441-443.

[7] 卓婧, 王静, 陈小霞, 等. 食品中合成色素快速检测仪器的研制[J].分析化学, 2011, 39(2): 283-287.

[8] 宋新, 纪双利, 杨丽, 等. 示波极谱法在食品合成食用色素测定中的应用[J]. 中国食品卫生杂志, 2009, 21(5): 422-423.

[9] 顾宇翔, 葛宇, 印杰, 等. 饮料和糖果中32 种水溶性色素的HPLC筛选性检测[J]. 食品工业, 2012, 33(8): 142-145.

[10] 奚星林, 邵仕萍, 徐娟, 等. 固相萃取-高效液相色谱法同时测定食品中12 种合成色素[J]. 中国食品卫生杂志, 2012, 24(3): 217-222.

[11] 辛若竹, 王静, 韩建秋, 等. 示波极谱法测定食品中合成着色剂的抗干扰性的研究[J]. 中国酿造, 2007, 26(1): 65-66.

[12] 李帮锐, 冯家力, 潘振球, 等. 高效液相色谱-质谱/质谱连用法测定饮料中的人工合成色素[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(4): 579-585.

[13] 丁轶聪, 陈淑琴. 反相高效液相色谱法测定糖果中诱惑红的含量[J].中国卫生检验杂志, 2009, 19(6): 1411-1412.

[14] 刘冷, 李建晴, 郭芬, 等. 紫外分光光度法同时测定柠檬黄和日落黄[J].光谱实验室, 2007, 24(3): 423-427.

[15] 孙磊龙, 杨志华. 高效液相色谱-变换波长测定饮料中8种色素[J].中国卫生检验杂志, 2010, 20(12): 3224-3226.

[16] 张婉, 王覃, 杜宁, 等. 超高效液相色谱法同时测定饮料中5种人工合成色素[J]. 食品科学, 2011, 32(4): 177-180.

[17] 陈鹏, 王微, 孙红, 等. 荧光光谱法快速测定饮料中的亮蓝[J]. 光谱实验室, 2012, 29(6): 3849-3852.

[18] 陈国庆, 吴亚敏, 魏柏林, 等. 应用导数荧光光谱和概率神经网络鉴别合成色素[J]. 物理学报, 2010, 59(7): 5100-5105.

[19] 饶通德, 陈书鸿, 张六一, 等. 磁性分离富集-分光光度法测定食品中的诱惑红[J]. 光谱实验室, 2012, 29(4): 2164-2168.

[20] 丁怡, 邱佩丽, 黄秋婷, 等. 固相萃取-高效液相色谱测定酒中合成色素[J]. 中国卫生检验杂志, 2009, 19(6): 1262-1264.

[21] 杨富春, 张宝元, 陈丹萍. 用高效液相色谱法同时测定葡萄酒中4 种色素含量方法的研究[J]. 江苏调味副食品, 2010, 27(3): 12-14.

[22] 张予林, 马静远, 王华. 变波长高效液相色谱法同时检测葡萄酒中4种合成色素的研究[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2011, 39(1): 186-192.

[23] 李广, 李琪, 京丽琼, 等. 高效液相色谱法同时测定葡萄酒中9 种人工合成色素[J], 中国酿造, 2013, 32(11): 132-135.

[24] 潘维莹, 李晓萍, 杜建中. 快速检验红葡萄酒添加合成色素方法的研究[J]. 湛江师范学院学报, 2012, 33(6): 94-97.

[25] 邓延倬, 何金兰. 高效毛细管电泳[M]. 北京: 科学出版社, 1996: 277.

Rapid Identification and Determination of Added Red Pigments in Red Wine

DU Jian-zhong, CHEN Ting, LIU Mu-qiu, LIANG Rong, CHEN Li-yan
(School of Chemistry Science and Technology, Zhanjiang Normal College, Zhanjiang 524048, China)

According to the chemical properties of anthocyanins in wine and the characteristics of commonly used red pigments, a simple, rapid and inexpensive lead acetate test strip assay was developed for the detection of added red pigments in red wine. Meanwhile, an analytical method to determine added synthetic red pigments, allura red, carmine and amaranth, in fake wine was proposed using capillary electrophoresis. The effects of running buffer type, concentration and pH value and separation voltage on the separation of the synthetic red pigments were investigated to establish the optimum experimental conditions. The best separation among allura red, carmine and amaranth was achieved within 6 min under the following conditions: 10 mmol/L NaH2PO4(pH 11) as running buffer, separation voltage 15 kV, and detection wavelength 215 nm.

red wine; lead acetate test strip; artificial pigment; capillary electrophoresis

S262.2

A

1002-6630（2014）10-0200-07

10.7506/spkx1002-6630-201410038

2013-09-23

杜建中（1956—），男，教授，本科，研究方向为分析化学及微量组分分析。E-mail：djz560119@126.com