固相萃取-高效液相色谱串联质谱法对黄粉虫中手性烯唑醇的分离测定

刘 琛，朱文学，曲昊杨，李建中，王会利，郭宝元,*

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2.中国科学院生态环境研究中心，北京 100085）

固相萃取-高效液相色谱串联质谱法对黄粉虫中手性烯唑醇的分离测定

刘 琛1,2，朱文学1，曲昊杨1，李建中2，王会利2，郭宝元1,2,*

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2.中国科学院生态环境研究中心，北京 100085）

建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法检测黄粉虫中手性农药烯唑醇的方法，对样品净化方法和色谱条件进行优化。样品经乙腈提取并加入正己烷液-液分配去脂后，经弗罗里硅土小柱净化，通过高效液相色谱-串联质谱仪以多选择反应监测模式进行分析测定。此方法对烯唑醇的检出限为0.002 mg/kg，回收率在97.22%～101.31%之间，相对标准偏差小于3%，具有操作简单、分离效果好、灵敏度和准确性高等特点。该法适合推广用于黄粉虫等昆虫体内烯唑醇含量的测定。

烯唑醇；黄粉虫；手性；固相萃取；高效液相色谱-串联质谱

烯唑醇是一种十分重要的三唑类内吸性杀菌剂，对植株具有保护、除草和生长调节等作用[1]，其通过抑制类固醇的去甲基化和破坏麦角甾醇的生物合成，可防治白绢病、多种锈病和黑穗病[2-3]，被广泛应用于农业生产过程中。烯唑醇在环境中具有较高的化学、光化学稳定性以及较低的生物降解性等[4]，随着在农业生产实践中的扩大使用，其对环境以及环境中的非靶标生物的危害也越来越大，甚至存在通过食物链危害到人类健康的风险。此外，目前市售的烯唑醇均以消旋体的形式销售，然而由于烯唑醇的一条疏水链上存在立体中心[5]，其手性分子存在两种形式（图1）并表现出不同的生物活性。其中，R-烯唑醇具有较高的杀菌活性，S-烯唑醇则具有较强的生长调节活性[6]。因此，以消旋体生产销售不仅仅会增加环境的负荷，还会对环境中的生物造成一定的危害。黄粉虫（Tenebrio molitor），又名面包虫，是一种源自于北美洲的高蛋白昆虫，由于其所具有的高蛋白特性[7]，目前被广泛应用于鱼类饲养和家禽养殖中。黄粉虫还能够作为有益微量元素的载体，将无机微量元素转化为有机微量元素以便于微量元素被人体吸收[8]，其已经作为食品的原材料进行生产。此外，昆虫能够通过肠道和皮肤等暴露途径摄取农药，成为农药在食物链中富集和扩散的媒介。因此，以昆虫中的黄粉虫作为手性农药烯唑醇的靶标生物，测定其体内的手性农药残留具有十分重要的意义。

图 1 S--烯唑醇和R-烯唑醇的分子结构Fig.1 Structures (absolute configurations) of S- and R-diniconazole

目前，国内外有关烯唑醇手性分离测定的研究主要集中在水果和环境介质方面，而对于它们在昆虫体中的分离检测方法报道较少，有关高效液相色谱串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）分离检测黄粉虫体中的烯唑醇方法的文献报道更少。文献报道的烯唑醇残留的检测方法主要有气相色谱法[9-11]、高效液相色谱法[11-12]、气相色谱-质谱联用法[13]和液相色谱-质谱联用法[14]等，其中对于烯唑醇手性分离的测定方法主要以液相色谱为主[15-20]，而HPLC-MS-MS具有灵敏度高和精确度高等优点在本实验中被选为烯唑醇残留分离测定的方法。

本实验以黄粉虫作为昆虫代表，对其体中烯唑醇的残留提取、净化和分析方法等方面进行研究，采用固相萃取高效液相色谱串联质谱法，对黄粉虫中的烯唑醇进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

黄粉虫（经检测体内无烯唑醇残留）采自北京昌平郊区农场。

烯唑醇消旋体标准品（纯度＞95%） 中国农业部农药检定所；甲醇、乙腈（均为色谱纯），甲酸、正己烷、丙酮（均为分析纯）、无水硫酸钠 北京化工厂；蒸馏水 屈臣氏中国有限公司。

ACQUITY超高效液相色谱仪、Quattro Premier XE质谱仪（配有电喷雾离子源） 美国Waters公司；DS-200型高速组织捣碎机 江苏省江阴市周庄科研器械厂；KQ-500B型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；RJ-TDL-40B低速台式大容量离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司；恒温水浴旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；佛罗里硅土固相萃取柱（1 g） 北京Dikma公司；0.22 μm混合纤维树脂微孔滤膜。

1.2 方法

1.2.1 储备溶液和标准溶液的配制

精确称取100 mg烯唑醇标准品于100 mL的容量瓶中，用甲醇定容，配制1 000 mg/L的储备溶液。使用前再用甲醇稀释配制成标准溶液。

1.2.2 样品的制备

1.2.2.1 样品的提取

将黄粉虫用组织捣碎机捣碎均匀后，称取试样1g放入50 mL的离心管中将加标后的黄粉虫样品静置30 min后，加入10 mL乙腈，超声10 min后以3 000 r/min的速率离心5 min，将上层清液转移至分液漏斗中（下层残渣重复以上步骤提取3次，合并提取液）。

1.2.2.2 净化

在分液漏斗中加入3×10 mL正己烷对提取液进行液液分配除脂，弃去上层正己烷，下层乙腈过无水硫酸钠柱（无水硫酸钠柱：将4.0 g无水硫酸钠填充于10 mL的小柱内）收集于圆底烧瓶中，35 ℃水浴旋转蒸干。蒸干所得残渣用3×1 mL丙酮-正己烷（1∶20，V/V）的混合溶剂溶解后过弗罗里硅土固相萃取柱。佛罗里硅土固相萃取柱使用前用丙酮和正己烷活化，并用丙酮-正己烷（1∶20，V/V）的混合溶剂调整。上样后，用10 mL丙酮-正己烷（1∶20，V/V）淋洗去杂。最后，弗罗里硅土柱用4 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）的混合溶剂洗脱，收集洗脱液于圆底烧瓶中，35 ℃水浴旋转蒸干。蒸干残渣用1.0 mL乙腈定容，过0.22 μm滤膜后，待测。

1.2.3 色谱条件

Chiralcel OD-3R手性色谱柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流动相：0.05%甲酸溶液-乙腈（40∶60，V/V）；流速：0.25 mL/min；进样量：5μL；柱温：30 ℃；外标法定量。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；离子源温度：120 ℃；毛细管电压：1.7kV；锥孔气（氮气）流量：50L/h；锥孔电压：30 V；去溶剂气（氮气）流量：600 L/h；去溶剂温度：350 ℃；母离子m/z 326.1，定量离子m/z 69.8，定性离子m/z 159.1；监测离子及碰撞能量：m/z 326.13＞69.82（24 eV），m/z 326.13＞159.13（36 eV）。

2 结果与分析

2.1 样品制备条件的选择

2.1.1 提取溶剂的选择

烯唑醇微溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯等有机溶剂。常用提取溶剂为丙酮、甲醇和乙腈，通过研究对比发现，甲醇和乙腈的提取效率均高于丙酮（表1），但甲醇较乙腈提取液中的杂质比较多（图2），影响后续净化，这是由于烯唑醇同丙酮、乙腈和甲醇均有较好的互溶性，但甲醇还会将黄粉虫中部分有机物杂质溶出，因此实验选择乙腈作为提取溶剂。

表1 黄粉虫中烯唑醇在不同提取溶剂下的回收率Table1 Recovery rates of diniconazole in Tenebrio moliittoorr wiitthh different extraction solvents

图2 乙腈（A）和甲醇（B）提取溶剂烯唑醇的加标回收实验Fig.2 Chromatographic separation of diniconazole in spiked samples using different extraction solvents

2.1.2 净化条件的选择

由于黄粉虫含有脂肪，在净化的过程中需加入一定量的正己烷进行液-液分配萃取，考察不同的正己烷加入量及萃取次数对后续药物提取的影响后发现，采用10 mL正己烷萃取3次效果最好。黄粉虫样品中含有大量有机物杂质，实验研究对比3种固相萃取柱——弗罗里硅土、中性氧化铝和PC/NH2在正相模式下的净化效果，结果如表2所示。中性氧化铝需要极性较强的混合溶剂才能将全部烯唑醇洗脱下来，相比较而言，弗罗里硅土需要的混合溶剂极性较小，而PC/NH2对药品的保留效果较强，即使使用纯丙酮作为洗脱溶剂，仍然洗脱不完全。因此，选择弗罗里硅土固相萃取柱最佳，其所需上样液的体积和极性都较小，在保证烯唑醇能被最大程度洗脱下来的同时可减少其他杂质的干扰。

表2 不同固相萃取柱中的烯唑醇回收率Table2 Recovery rates of diniconazole with different solid phase extraction columns

2.2 固相萃取条件的优化

2.2.1 上样液的选择

文献[21]报道用丙酮-正己烷（1∶9，V/V）的混合溶剂作为三唑类农药戊唑醇的上样溶液，本实验发现丙酮与正己烷体积比1∶9的上样液会将部分烯唑醇直接洗脱下来，影响回收率。由于纯正己烷的极性较小，不能够将烯唑醇完全溶解在上样液中，故上样液选择丙酮-正己烷（1∶20，V/V）混合溶剂为最佳。

2.2.2 淋洗液的选择

实验对比丙酮-正己烷（1∶20，V/V）分别为5、10、15 mL及10 mL纯正己烷溶剂淋洗固相柱的去杂效果。发现使用10 mL极性较小的纯正己烷或者体积较大的混合溶剂进行淋洗，会造成烯唑醇的损失，平均回收率仅为77.2%；使用体积较小的混合溶剂淋洗时，平均回收率也仅为85.7%，同时会造成杂质峰的严重干扰。最终选择10 mL的丙酮-正己烷（1∶20，V/V）混合溶剂进行洗脱，保证了去杂效果和回收率。

2.2.3 洗脱液的选择

本实验采用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）的混合溶剂进行洗脱，对比了分别用混合溶剂10 mL一次性洗脱和4 mL/次分2次洗脱的洗脱效果。发现用10 mL混合溶剂进行洗脱后的峰受杂质峰影响较大，用4 mL混合溶剂第1次洗脱时即可将烯唑醇完全洗脱下来，第2次洗脱后只有杂质峰出现。最终，本实验采用4 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）混合溶剂进行洗脱，标样洗脱色谱图见图3。

图3 烯唑醇标样的色谱分离图Fig.3 Chromatographic separation of diniconazole in standard sample

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱的选择

本实验对比2种色谱柱：C h i r a l O D-3R[cellulose tris-（3,5-dimethylphenyl-carbamate）（4.6 m m×2 5 0 m m，5 μ m）和C h i r a l PA KIC[cellulose tris-（3,5-dichlorophenyl-carbamate）]（4.6 mm×150 mm，3 μm），按照1.2.3、1.2.4节的色谱、质谱条件测定1 øg/mL的烯唑醇的标准溶液，根据图4所示的分离效果，选择ChiralOD-3R手性色谱柱为实验所用。

图4 ChiralPAK-IICC柱（A）和Chiral OD--33RR柱（B）对烯唑醇分离的色谱图Fig.4 Chromatograms of diniconazole on two different columns

2.3.2 流动相的选择

首先，实验对比了乙腈和水在流动相中的比例。结果发现，乙腈比例过小会导致烯唑醇的保留时间会过长而影响实验时间；乙腈比例过大时会使烯唑醇的保留时间变短而不利于目标峰与其他杂质峰的分离；故选择水-乙腈（60∶40，V/V）作为流动相，分离效果十分理想。其次，实验选用水和不同比例的甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%）与乙腈配比作为流动相进行比较以提高信号响应。结果表明，加入甲酸的流动相洗脱烯唑醇后的响应值均高于纯水和乙腈组成的流动相洗脱的响应值；当甲酸的加入量提高后，洗脱烯唑醇后的信号响应值反而受到降低，因而选择0.05%的甲酸溶液和乙腈作为流动相。

2.3.3 质谱参数的优化

色谱峰在流速0.25 mL/min、柱温30 ℃时峰形和分离度最好。用Optimizer优化软件对烯唑醇的质谱参数进行优化，选择监测离子及碰撞能量分别为m/z 326.13＞69.82（24 eV），m/z 326.13＞159.13（36 eV）。在确定了母离子和子离子的基础上，对毛细管电压和锥孔电压进行了优化，分别为1.7 kV和35 V。

2.4 线性范围和检出限

将烯唑醇标准储备液稀释为0.005～2.00 mg/L 5个质量浓度，在选定的色谱条件下依次测定，峰面积（y）与相应的质量浓度（x）呈正比，进行线性回归得S-烯唑醇和R-烯唑醇的方程分别为：y=865 832x－808.419（R2=0.999 7）；y=869 478x－320.249（R2=0.999 9）。以信噪比为3作为检出限的判断标准，检出限为0.002 mg/kg。

2.5 方法精密度和添加回收率

表3 黄粉虫中烯唑醇的平均回收率和相对标准偏差（n==66）Table3 Average recovery rates and relative standard deviations of diniconazolee iinn Tenebrio moliittoorr (nn == 66))

在优化的实验条件下，在空白黄粉虫样品中分别添加烯唑醇的标准溶液，使黄粉虫样品中的的质量浓度分别达到0.01、0.1、2.0 mg/kg，每个添加量平行测定6次，回收率及精密度实验结果见表3。样品在3个添加水平的烯唑醇平均回收率为97.22%～101.31%，相对标准偏差小于3%，具有良好的精密度。

2.6 实际样品的测定

空白黄粉虫中，未检测到烯唑醇。对投喂2.0 mg/kg烯唑醇的黄粉虫进行了检测。分别取投喂0.375、1、2、7 d的黄粉虫1.0g，检测其体中的烯唑醇含量在0.019～0.062 mg/kg之间，检测灵敏度高，方法适用度好。

3 结 论

本实验采用固相萃取-高效液相色谱串联质谱法在实验室条件下对黄粉虫中的手性农药烯唑醇进行测定，方法操作简单、快速，具有分离效果好，灵敏度高、准确性、重复性好等特点。适合推广用于黄粉虫等昆虫体内手性农药烯唑醇含量的测定。

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Determination of Chiral Diniconazole in Tenebrio molitor by Solid Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Chen1,2, ZHU Wen-xue1, QU Hao-yang1, LI Jian-zhong2, WANG Hui-li2, GUO Bao-yuan1,2,*
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China)

A method for analysis of chiral diniconazole in Tenebrio molitor using solid phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-HPLC-MS-MS) was developed. Sample purification and HPLC-MS-MS conditions were optimized. Acetonitrile extracts of samples were degreased with acetonitrile by liquid-liquid partition and cleaned up using a Florisil solid phase extraction cartridge before analysis by HPLC-MS-MS in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The limit of detection of this method was found to be 0.002 mg/kg. The recoveries were in the range of 97.22% to 101.31%, with RSD less than 3%. This method has the advantages of easy operation, good separation, high sensitivity and precision. It is suitable to determine diniconazole residues in Tenebrio molitor and other insects.

diniconazole; Tenebrio molitor; chiral; solid phase extraction (SPE); high-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS)

TQ455.4

A

1002-6630（2014）02-0154-04

10.7506/spkx1002-6630-201402028

2013-04-08

国家自然科学基金面上项目（21277163）；中国科学院重要方向性项目（KZCX2-YW-JS403）

刘琛（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：leinali@foxmail.com

*通信作者：郭宝元（1976—），男，副研究员，博士，研究方向为环境分析化学。E-mail：guoby@rcees.ac.cn