东北红豆杉种子发育过程生理特性研究

秦祎婷，李雪，翟志席，董学会

（中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）

东北红豆杉种子发育过程生理特性研究

秦祎婷，李雪，翟志席，董学会*

（中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）

文章对红豆杉种子发育形态学、物质积累以及内源激素水平等进行调查。结果表明，种子在12 WAP（Weeks after pollination，发育周数）时含水量约为22%。种子可溶性糖含量在发育过程中变化较大，在2 WAP时为19%，达到整个发育过程的峰值。而可溶性蛋白质含量则随着种子发育逐渐增加，在12 WAP时达到峰值，为17%。10 WAP时，总脂肪酸含量最高，为干重的31.98 mg·g-1。在内源激素方面，种子中ABA水平在12 WAP降至最低，而GA含量呈总体下降趋势。

东北红豆杉；种子发育；种子形态学；脂肪酸

植物种子在采收时的发育程度和物质积累，是决定种子萌发能力的重要因素[1-2]。从种子形成和发育阶段入手研究东北红豆杉种子发育特点是了解其休眠成因的重要途径。Flores等对红豆杉Taxusxmedia（var.Hicksii,var.Wardi,var.Citation, and var.Sunburst），短叶红豆杉Taxus brevifolia，欧洲紫杉Taxus baccata进行研究，将采收的种子分成五个成熟等级：LG，种子呈浅绿色且无假果皮；G，种子呈墨绿色；EA，具有正在发育的粉红色假果皮种皮；RG，具有发育完全的假果皮青色种子；RD，具有深红色发育完全假果皮深褐色种子。在这五个等级当中，G级种子萌发率最高，可达70%。而成熟度高于G级的RG和RD发芽率则低于10%。这是由于种子脱水使得种皮更加坚硬致密，对种胚产生机械约束[3]。

红豆杉种子的形成过程与种子成熟及休眠有密切联系，在种子发育过程中，若外界环境条件恶劣，多种因素可导致种子休眠。当种子发育处于高温或低湿状态下时，种皮脱水程度较高，导致种皮质地较为坚硬，对种胚发育形成约束，迫使种子进入休眠；另外，种子中的内源ABA对逆境响应，当环境条件恶劣时，则会调控种子进入休眠状态。张艳杰等研究表明，种皮中的萌发抑制物质也是诱导休眠的重要因素之一。南方红豆杉种子的种皮浸提液可对其他植物种子的萌发进行抑制[4-6]。

东北红豆杉种子休眠主要受到种皮约束、营养物质积累及内源激素水平等因素影响，目前，有关东北红豆杉种子休眠成因研究未见报道。本研究针对东北红豆杉种子发育特点，对发育过程中的形态学、物质积累以及内源激素水平等指标进行调查，并进一步研究种皮发育过程以及可溶性糖、蛋白质、脂肪酸的积累特点，旨在通过了解东北红豆杉种子发育过程的生理特性，对种子休眠形成原因进行探讨，为东北红豆杉种子休眠机制以及解除休眠技术研究提供参考和依据，为东北红豆杉物种保护工作提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 种子样品

本研究所用种子样品，均取自中国吉林省集安市东北红豆杉苗木基地（E 125°34′,N 40°52′）。红豆杉苗木基地位于集安市针阔叶混交林区。

为探讨种子发育过程中的生理变化和形态变化，于种子形成至种子成熟过程中的关键时间点进行取样，发育阶段取样方法为：4 WAP-形成初期，种皮青色；6 WAP-种皮青色，无假果皮；8 WAP-种皮浅褐色，假果皮青色；10 WAP-种皮褐色，假果皮粉红色；12 WAP-种皮深褐色，假果皮红色。

1.2 显微扫描电镜成像

本研究使用的成像仪器为TM3000台式扫描电镜（日本，HITACHI）。将红豆杉种子样品进行纵切，剖面向上，将种子用碳双面胶固定于样品台上，调整样品台高度，置于样品室中。待样品室成为真空状态，即可开始扫描。

1.3 解剖镜成像

使用Motic体视显微镜，将待检测的种子样品进行整体外观以及纵切面的解剖成像，放大倍数为6倍，使用白色背景。利用motic 2.0软件进行拍照，并测量种胚长度和宽度。

1.4 可溶性糖含量测定方法

采用蒽酮法测定可溶性糖含量。每个种子样品取100 mg干样粉末，加入4 mL 80%乙醇溶液后，于80℃水浴加热40 min，3 500 r·min-1离心10 min，收集上清液。向残渣中再加入4 mL 80%乙醇溶液，进行第2次提取。合并上清液，并定容至25 mL。取1 mL样品提取液，加入5 mL蒽酮试剂，充分摇匀，沸水浴10 min。加热后投入自来水中冷却，20 min后于分光光度计620 nm处测定OD值。然后从标准曲线上查出相应糖含量，计算样品含糖量。每个样品3次重复。

1.5 蛋白质含量测定方法

采用考马斯亮蓝法对种子样品蛋白质含量进行测定。称取100 mg种子干样，置于研钵中，加入10 mL磷酸缓冲液（pH 7.0），研磨至匀浆。在10 000×g离心力下，离心10 min，取上清。再向残渣中加入5 mL磷酸缓冲液，充分摇匀后再次离心，合并上清液，并定容至25 mL。准确吸取0.1 mL样品提取液，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，充分混匀后，于分光光度计595 nm处测定OD值。并根据标准曲线，计算蛋白质浓度。每个样品3次重复。

1.6 脂肪酸含量测定方法

脂肪酸提取采用改进后的Sukhija和Palmquist方法[7]。每个样品需准确称取100 mg种子干样粉末，用移液管加4 mL无水甲醇∶氯乙酰（10∶1）的混合液，5 mL内标，振荡混匀，80℃水浴2 h。水浴结束后取出，冷却到室温，加5 mL 7%K2CO3溶液中和脂肪酸。吸取上清于样品瓶中，置4℃冰箱待于气相色谱上机。

样品检测仪器为安捷伦气相色谱仪HP6890和HP7890，分离柱为Inner-Wax极性柱。每个样品重复两次，两次重复的平均值为种子脂肪酸含量。

1.7 内源激素含量测定

利用酶联免疫法（ELISA）对红豆杉种子内源ABA与GA水平测定。每个样品称取100 mg鲜样，加入5 mL样品提取液，在冰浴上研磨至匀浆，转入10 mL离心管中，摇匀后置于4℃条件下提取4 h。提取结束后，1 000 g×离心15 min，保留上清液。为避免杂质和色素干扰测定结果，需将上清液过C18固相萃取柱。将过柱后收集的样品提取液用氮气吹干，用样品稀释液定容至2 mL。

在96孔酶标板中加入标样和待测样，每个样品加3孔，每孔50 μL。在标样和待测样孔中分别加入50 μL抗体，37℃温育30 min。洗板后在每孔中加入100 μL二抗，37℃温育30 min，洗板。在每孔中加入100 μL底物显色液，当显色适当后，加入100 μL终止液终止反应。最高浓度标准液调0，在酶联免疫分光光度计490 nm处进行测定。

使用标准液浓度的自然对数为横坐标，OD值的logit值为纵坐标，绘制标准曲线。利用标准曲线计算样品浓度和含量。

2 结果与分析

2.1 种子形态发育

种子在发育进程中，形态变化与生理变化有密切联系。在发育过程中，红豆杉种子种皮由单层发育成多层。红豆杉种子发育过程的形态学变化如图1所示。

由图1可知，在种子发育初期，种皮组织幼嫩，且为疏松多层结构（4 WAP）。随着发育进行，种皮组织逐渐形成内外两层，且结构致密，质地坚硬。而种子在4 WAP时，种子表皮呈嫩绿色；随着种子发育，以及种子逐渐脱水，种皮颜色由青色逐步转变为棕褐色。由此可见，种子发育过程中，种皮机械约束逐渐形成。至种子成熟时，种皮分为内外两层，含水量低，导致种皮机械约束大，种胚生长受到抑制，进入休眠。

图1 东北红豆杉种子形态发育过程Fig.1 Seed morphological developing in Japanese yew

2.2 种子发育与含水量

由图2可知，种子水分含量变化，6～8 WAP有明显下降。从8 WAP开始，含水量趋于稳定。因此推断，在东北红豆杉种子成熟过程中，有脱水干燥和代谢物积累发生。种子脱落时含水量约为22%。在种子发育至4 WAP时，种子体积小，含水量较低，而在6 WAP时，种子含水量达到峰值，此时种子体积膨大，种胚开始形成。6 WAP后，种子开始脱水，含水量逐渐降低，但干重缓慢增加，此时种子中的主要成分由水分变为营养贮藏物质。8～12 WAP，种子因脱水而体积减小，颜色加深。

2.3 种子发育与物质积累

2.3.1 可溶性糖含量

种子成熟过程中，糖含量的变化较为明显（见图3）。在2 WAP时，糖含量为19%，达到整个发育过程的峰值；在4～8 WAP时，种子可溶性糖含量持续下降，而在10 WAP出现小幅上升后，继而下降；直至种子成熟（12 WAP）时，种子中可溶性糖水平最低。种子形成初期，种胚并未分化形成，种皮内为多层分生组织。此时，种子中正进行组织分化等生理活动，对糖需求较大。随着发育进行，种子消耗糖类同时也进行物质积累，将糖类物质由可溶性游离态转化为不可溶的贮藏物质。在8～10 WAP期间，种子开始脱水，使种子中糖的比重变大，因而出现短暂的上升过程。

图2 东北红豆杉种子发育过程中干重与鲜重变化Fig.2 Changes of DMW and FMW in Japanese yew during seed development

图3 东北红豆杉种子发育过程中可溶性糖含量变化Fig.3 Changes of soluble sugar content in Japanese yew during seed development

2.3.2 可溶性蛋白含量

蛋白质含量如图4所示，在整个发育过程中呈上升趋势。从4～6 WAP，种子蛋白质含量上升速度最快，而在6～10 WAP几乎维持在同一水平，在10～12 WAP，又出现较为明显的增加，在12 WAP时达到峰值，为17%。

图4 东北红豆杉种子发育过程中可溶性蛋白质含量变化Fig.4 Changes of soluble protein content in Japanese yew during seed development

2.3.3 脂肪酸组分及含量

种子完全成熟（12 WAP）时，总脂肪酸（TFA）含量为干重（DM）的27.86 mg·g-1（见表1）。色谱分析结果表明，种子中主要脂肪酸类型可分为：饱和脂肪酸，代表是软脂酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0），分别占总脂肪酸的11.8%和2.5%；单不饱和脂肪酸，代表是棕榈油酸（C16:1）和油酸（C18:1），分别占总脂肪酸的1.6%和73.0%；以及多不饱和脂肪酸（PUFAs），代表是亚油酸（C18:2）和亚麻酸（C18:3），分别占总脂肪酸的10.3%和0.9%。

由表1可知，在刚形成的种子中，亚油酸（C18:2）是主要脂肪酸（为TFA的40%）。数据取平均值后，软脂酸和亚麻酸也占一定比重，分别为TFA的28%和15%。在种子发育过程中，亚油酸、软脂酸和亚麻酸含量均明显下降。而与此相反，从受精后第9周开始油酸含量增加并成为最重要的脂肪酸组分，达到73%。结果与Chahed等对阿月混子树研究相似[8]。在种子发育过程中，PUFA主要组分亚油酸和亚麻酸，随着油酸的增加而减少。因此在种子形成初期，脱氢酶活性很高，但是在完全成熟的种子中处于抑制状态，使油酸不被氧化。此现象同样出现在鳄梨中[9]。

东北红豆杉种子形成和发育过程中，总脂肪酸含量变化见表1。TFA含量在6 WAP（15.94 mg·g-1DM）开始增加，在10 WAP达到31.98 mg·g-1DM，随后因为油酸减少而轻微下降（见表1）。当种子成熟时，脂肪酶被激活，胚可利用自身营养物质。从4 WAP至6 WAP，软脂酸（C16:0）、油酸（C18: 1）和亚油酸（C18:2）含量增加，在种子完全成熟时，分别达到43.52、268.71和37.74 mg·g-1DM（见表1）。

从第10WAP开始，最为丰富的油酸含量开始下降，标志种子已经成熟，此时其他脂肪酸组分含量很低并保持恒定。因此，脂肪酸总量的增加尤其是油酸含量，证明脂肪酸合酶（FAS）系统在第10 WAP被激活[10]。同时观察到，油酸和亚油酸在演变中朝相反方向变化。

表1 东北红豆杉种子发育过程中种子内脂肪酸含量Table 1 FAs contents in Japanese yew seeds during seed development (mg·g-1DM)

2.4 种子发育与内源激素

由于ABA和GA在种子休眠形成过程中起主要调控作用，本研究对发育过程中的种子样品进行内源ABA和GA水平调查，结果如图5所示。种子在正常发育过程中，胚的ABA含量于6 WAP迅速下降，在8 WAP达到峰值，之后随着种子发育的进行不断下降。直至种子成熟时（12 WAP），种子中ABA水平降至最低。种子在正常发育过程中GA含量呈总体下降趋势。在种子形成初期（4 WAP），种子中GA水平为最高。在6～8 WAP，其含量迅速下降，此时ABA迅速增加。而8～12 WAP，种子中GA含量维持在较低水平。

在种子形成初期（4 WAP），GA对种子生长和分化起主要作用。此时ABA参与种子中物质积累调控。在6 WAP时，种子体积膨大，此时种子含水量较高，较低ABA水平有利于水分增加。当种子发育至8 WAP，处于成熟脱水阶段，此时内源ABA含量最高，有利于成熟脱水过程的进行。此时ABA含量达到峰值，由于ABA与GA之间存在一定拮抗作用，在8 WAP时种子内源GA含量最低。

图5 东北红豆杉种子发育过程中内源激素的动态变化Fig.5 Dynamic changes of endogenous hormone in Japanese yew during seed development

3 讨论与结论

通过调查东北红豆杉种子形态学与生理发育过程，以显微镜与扫描电镜采集种子外观及内部形态、结构数据，本文采用分光光度法对各发育阶段种子可溶性糖与蛋白含量进行测定，研究种子发育过程中种子脂肪酸组分及内源激素水平动态变化，为东北红豆杉种子休眠机理研究提供依据。

3.1 红豆杉种子发育特点

红豆杉种子在形成初期，内部并无胚与胚乳，而是由多层分生组织构成。在初期，种皮柔软幼嫩，并在发育成熟过程中逐渐变厚，至种子脱水变色期，种皮已成为两层坚硬致密的“壳”，对种胚的发育进行限制。

本研究结果发现，红豆杉种子发育过程中，种子含水量先快速增加，然后逐渐脱水。在种子膨大期含水量最高，此时种子体积最大，种皮呈青色。在种子发育中后期，种子开始脱水，并且种皮颜色变深，种子体积变小。

3.2 种子发育与物质积累的关系

种子形成和发育过程中，用于各种生理反应的可溶性糖含量呈下降趋势，而用于贮藏脂肪酸和可溶性蛋白质含量呈整体上升趋势。表明，红豆杉种子在发育后期的生理活动强度减弱，并将营养物质转化为贮藏物质，进入休眠状态。

种子发育与ABA的代谢合成有紧密关系[11-14]，在种子开始脱水的发育中期，ABA含量达到峰值。而在种子发育后期，种子基本处于休眠状态，ABA含量与GA含量均最低。

3.3 种子发育与休眠的关系

红豆杉种子在发育过程中，种皮逐渐脱水，而种胚发育较慢。直至种子从母株上脱落后，种皮坚硬致密，而种胚发育程度并未达到成熟标准。此时，种皮的机械约束限制种胚生长，被迫进入休眠状态。

而在种子发育过程中，营养物质由活动态向贮藏态的转化也使种子进入静默状态。ABA和GA对种子的调控高峰在种子发育初期和中期，而在种子进入休眠态后，内源激素含量降至最低。表明种子在发育后期，内源激素对其生理活动的调控作用较弱。

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Study on physiological property inTaxus cuspidataduring seed development

QIN Yiting,LI Xue,ZHAI Zhixi,DONG Xuehui
(School of Agronomy and Biotechnology,ChinaAgricultural University,Beijing 100193,China)

This research focuses on the changes of morphology,nutrition accumulation and endogenous hormone levels.The results showed that the water content of Japanese yew seed peaked at 12 WAP(WAP,Weeks after pollination),was 22%.The sugar content peaked at 2 WAP,was 19%.The protein content increased during seed development,and it peaked at 12 WAP,was 17%.The content of total fatty acids peaked at 10 WAP,was 31.98 mg·g-1DM.The lowest level of ABA was appeared at 12 WAP,and GA level decreased during seed development.

Taxus cuspidata;seed development;seed morphology;fat acids

S330.3

A

1005-9369（2014）11-0008-06

2014-06-05

国家自然科学基金项目（30570180）

秦祎婷（1987-），女，博士研究生，研究方向为种子分子生物学。E-mail:qyt_729@126.com *通讯作者：董学会，教授，博士生导师，研究方向为种子分子生物学。E-mail:xuehuidong@cau.edu.cn

时间2014-11-21 16:40:42[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141121.1640.010.html

秦祎婷,李雪,翟志席,等.东北红豆杉种子发育过程生理特性研究[J].东北农业大学学报,2014,45(11):8-13.

Qin Yiting,Li Xue,Zhai Zhixi,et al.Study on physiological property inTaxus cuspidataduring seed de-velopment[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(11):8-13.(in Chinese with English abstract)