模拟海拔5000 米高原低氧环境对大鼠肾脏氧化应激和NADPH 氧化酶的影响

石 丽 王颖超 罗朋力

高海拔缺氧可以造成循环血中氧分压或氧含量下降致使组织细胞供氧不足，产生一系列病理状态。缺氧发生后，肾脏是容易受损的器官，高原急性缺氧所致肾损伤进一步引起急性肾功能障碍，甚至多器官功能障碍及衰竭［1～3］。既往研究表明，氧化应激是高原急性缺氧时肾脏损伤的重要机制之一，而NADPH氧化酶的激活则是机体产生氧化应激的重要原因［4～6］。笔者通过复制大鼠肾脏高原急性缺氧损伤模型，通过检测肾组织氧化应激相关指标的变化及急性缺氧后不同时程点大鼠肾脏NOX4 和P47phox 蛋白水平的表达变化，为有效预防肾脏缺氧损伤提供相关实验依据。

材料与方法

1.实验动物及试剂:7 周龄健康清洁级SD 大鼠60 只，均为雄性，体重180 ～200g，由兰州大学动物实验中心提供(实验动物合格证号:0002511)，经适应性喂养两周后用于实验。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;);NOX4 和P47phox 一抗(北京博奥森生物技术有限公司生产，1∶2000);β-actin 单克隆抗体(美国Sigma 公司，1∶2000);二抗(DAK 公司，1∶2000)

2.实验方法:(1)复制急性缺氧动物模型:使用青海大学医学院高原医学研究中心低压氧舱模拟海拔5000 米高原低氧环境复制动物模型，将大鼠按照进入低压氧舱的时间分为0.5、1、3、5、7 天，同时设置对照组(西宁地区)等6 个组。(2)血液血肌酐、尿素氮测定:大鼠腹主动脉采血，3000r/min、15min 离心，离心后吸取上清液，取血清保存于-80℃冰箱里备用。用生化仪来测定血尿素氮(Bun)和血肌酐(Scr)水平。(3)氧化指标SOD、MDA 测定:严格按试剂盒说明书，测定肾脏组织中SOD、MDA 含量。(4)肾脏NOX4、P47phox 蛋白含量:Western blot 法检测肾脏组织NOX4、P47PHOX 蛋白的表达。取肾脏组织200mg，提取组织蛋白以BCA 蛋白分析法测蛋白浓度。电泳后，转移至PVDF 膜上，封闭1h，加入一抗和β-actin 单克隆抗体，4℃过夜，二抗室温孵育1h，洗涤，ECL显示条带。

结 果

1.大鼠血肌酐、尿素氮改变:随着缺氧时间的延长，大鼠肌酐及尿素氮水平呈先升高后下降的趋势(图1)。

图1 大鼠不同缺氧时间血清肌酐、尿素氮浓度变化

2.氧化相关指标变化:肾脏SOD 水平一直下降，差异具有统计学意义(P ＜0.05)，MDA 表达水平总体呈升高趋势，但差异无统计学意义(P ＞0.05，图2)。

3.蛋白表达变化:大鼠肾脏NOX4 及P47phox 蛋白表达均随着缺氧时间延长而开始升高，于5 天后开始降低，7 天恢复大致正常水平(图3)。

讨 论

图2 大鼠不同缺氧时间肾脏SOD、MDA 的表达变化

图3 大鼠不同时程肾脏蛋白表达变化

机体处于高海拔环境会引发一系列连锁反应，在生理、心理和行为等各层次都会发生一定变化［5～10］。本研究利用低压氧舱模仿高原5000 米缺氧环境，实验条件可以模仿高原缺氧环境，通过比较不同时间内氧分压和动脉血氧饱和度下降程度，来观察全身各个器官的功能、甚至结构的变化，其中肾脏对缺氧很敏感。既往研究表明，氧化应激在缺氧所致肾损伤中起着重要作用［5～7］。所谓氧化应激是由于人体新陈代谢过程中产生的“自由基”产生过多，超过了正常组织的抗氧化防御系统。高原缺氧状态可导致氧化应激增加和机体的抗氧化功能下降，是引发急性肾衰竭等多种疾病的重要原因。

本研究通过对血清肌酐、尿素氮浓度的测定，发现肌酐、尿素氮自缺氧12h 就开始升高，5 天后开始下降。说明高原缺氧状态确实对大鼠肾脏造成一定程度的损伤，之后其浓度的下降，可能是机体对高原缺氧环境的逐渐习服过程。通过观察肾脏高原急性缺氧时SOD、MDA 水平变化，表明高原缺氧对肾脏造成的损伤机制，可能是由于肾细胞及器官水平缺氧造成SOD 活力下降、MDA 水平升高，肾组织清除氧自由基的能力下降，从而使机体产生极多氧自由基和各种蛋白水解酶、炎性物质，进一步发生脂质过氧化反应。相关研究表明，过多ROS 产生使机体抗氧化能力下降，氧化/还原动态失衡，造成机体蛋白质、脂质、核酸等的氧化损伤，使机体处于一种严重的应激状态［4～7］。ROS 是由氧激发的化学性质十分活泼的分子，近年来研究显示，NADPH 氧化酶的过度活化可能是细胞内ROS 高表达的重要原因，它在炎症和肾损伤等疾病中发挥重要作用，P47phox 和NOX4 等亚基则是激活NADPH 氧化酶的关键亚基，可能会进一步介导ROS 产生，使机体产生氧化应激［3～6］。本实验通过测定P47phox 和NOX4 两个亚基蛋白表达情况，发现其表达量随着缺氧时间的延长逐渐升高，可能随着机体对氧化应激的适应，缺氧后期表达量有所下降。可以推测高原缺氧可能诱导了NADPH 氧化酶的表达，造成肾脏病理损伤。因此通过抑制NADPH氧化酶的活性可有效的降低ROS 的产生，从而减轻高原急性缺氧所引起的肾脏病变。

总之，本结果模拟在低压氧舱急性缺氧的病理过程中，NADPH 氧化酶可能起到重要作用，因此对NADPH 氧化酶的抑制尤为重要。缺氧肾脏损伤的发生涉及很多复杂因素，本研究从一个侧面推测了高原缺氧所致肾损伤的发病机制，为进一步探讨高原环境下防治肾损伤提供了实验依据。

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