耐辐射奇异球菌R12海藻糖合成酶基因的克隆与表达

吴 茜，杨 鑫，朱丽英，张婧涵，徐 娴，江 凌，

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，江苏 南京210009；2.南京工业大学食品与轻工学院，江苏 南京210009；3.南京工业大学理学院，江苏 南京210009）

耐辐射奇异球菌（Deinococcus wulumuqiensis）R12是一类极端微生物，它不仅对电离辐射、紫外辐射以及许多DNA损伤试剂具有抗性，还对干燥、过氧化物等具有较强的抗性。研究表明，耐辐射奇异球菌在环境胁迫下具有合成海藻糖的能力［1］。海藻糖是一种非还原性二糖，由2分子葡萄糖以1，1－糖苷键连接而成，其化学性质极稳定，无毒无害，不会焦糖化，是一种安全的天然多糖。海藻糖广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中，既是一种贮存性糖类，又是应激代谢的重要产物。由于海藻糖具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境下活性免遭破坏的功能，已被广泛应用到医药、化妆品、食品加工、农业等领域［2－3］，受到研究者的广泛关注，发展前景广阔。

海藻糖有多种合成方法，如：天然生物提取法、化学合成法、微生物发酵法、基因工程法等，但都有一定弊端，而海藻糖合成酶以其一步催化的优点，成为近年来研究热点［4－6］。其催化过程能耗低、底物麦芽糖来源广且价格低，使得生产成本大大降低；此外，海藻糖合成酶特异性较强，只作用于麦芽糖转化成海藻糖，工艺简单，易于调控。因此，以麦芽糖为原料利用海藻糖合成酶生产海藻糖是一条极具工业化前景的途径［7－8］。

1 实验

1.1 材料与试剂

菌株Deinococcus wulumuqiensis R12、E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3），自行保存；质粒PMD18Tvector、pET－22b（＋），TAKARA公司。

酵母粉、蛋白胨，英国OXOID公司；DNA marker、DNA凝胶回收试剂盒，TAKARA公司；氨苄青霉素，南京生兴生物有限公司；琼脂糖，Promega分装；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取［9］

取1～4mL野生型D.wulumuqiensis R12的过夜培养物，于12 000r·min－1离心2min，弃上清。细菌沉淀加入150μL的TE buffer（含RNaseA1），用枪吸打至充分悬浮细菌沉淀，提取总DNA。

1.2.2 基因克隆和重组表达载体构建

根据GenBank公布的序列设计引物，下划线部分分别为BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点：

上游引物F：CGGGATCCGATGACGCAAGCA－CAAC

下游引物R：CAAGCTTGTTCAGCCGCAGCCAGT

PCR条件为：94℃预变性5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1min；完成30个循环后72℃延伸5min。

PCR扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片断，与T载体连接，转化E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，送样测序。

经测序无误后小量提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ对质粒及表达载体pET－22b进行双酶切，分别回收目的片段，连接后转化E.coli DH5α，挑取阳性克隆提取质粒，转化表达E.coli BL21（DE3）。

1.2.3 重组菌的诱导表达

挑取重组菌单菌落至LB氨苄液体培养基中，37℃振荡过夜后，按1%的接种量转接至新的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600值达0.6，加IPTG至终浓度为1mmol·L－1，诱导4h、6h、8h，等量取样，10 000r·min－1离心2min，收集菌体。

1.2.4 表达产物的SDS－PAGE分析［10］

取发酵液2mL，离心，收集菌体，加PBS重悬，冰浴超声破碎（工作4s，间隔2s，总5min）后，于10 000 r·min－1、4℃离心10min，取上清，加入2倍上清体积的缓冲溶液，沸水浴5min，取23μL点样，进行SDS－PAGE分析。

1.2.5 重组酶的酶活测定

取发酵液2mL，离心，收集菌体，加PBS重悬，冰浴超声破碎（工作4s，间隔2s，总5min）后，于10 000 r·min－1、4℃离心10min，取上清，即为粗酶液。取粗酶液100μL与等体积的质量分数为30%的麦芽糖溶液混合，静置30min，沸水浴5min终止反应。

1.2.6 含量测定

离心收集反应液的上清，稀释1 000倍进样。使用Ultimate 3000型高效液相色谱仪进行含量测定。色谱柱为氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈－水（67∶33，体积比）；流速0.9mL·min－1；柱温35℃；检测器为示差折光检测器；进样量10μL。

2 结果与讨论

2.1 海藻糖合成酶基因treS表达载体的构建

图1 D.wulumuqiensis R12中海藻糖合成酶基因treS的序列Fig.1 Gene sequence of treSin D.wulumuqiensis R12

应用Illumina HiSeq系统测定了D.wulumuqiensis R12的基因组草图［11］，在GenBank中进行核酸序列的Blast检索分析。结果发现，其核酸序列与已报道的D.wulumuqiensis R12中海藻糖合成酶基因treS的核酸序列（图1）有95%的同源性。

以D.wulumuqiensis R12总DNA为模板，F、R为引物进行PCR扩增，得到分子量约1 700bp的DNA片段，与目的基因大小相符。将扩增得到的DNA片段回收后与T载体连接，转化E.coli DH5α，经测序无误后小量提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ对质粒及表达载体pET－22b进行双酶切，连接后转化E.coli DH5α，菌落经PCR验证为阳性克隆（图2）。

2.2 表达产物的SDS－PAGE分析

图2 重组菌菌落鉴定Fig.2 Identification of recombinant bacteria colony

重组菌经IPTG诱导表达后，离心收集菌体，用PBS缓冲溶液重悬菌体，在冰上经超声破碎后，离心，分离上清和沉淀。用0.4μm滤膜过滤上清后，用Ni柱和His－tag的亲和性进行分离和纯化，将粗酶液和纯化液进行SDS－PAGE分析，结果见图3。

图3 重组表达蛋白的SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis of recombinant expression proteins by SDS－PAGE

由图3可看出，与图3b中2、3泳道含空载体的表达宿主蛋白相比，图3a中重组菌表达出大小约66 kDa的目的蛋白，经纯化后，图3a中7、9泳道纯化蛋白达到分析纯，可用于后续酶学性质研究。

2.3 重组酶性质的初步研究

以30%的麦芽糖为底物和重组酶进行麦芽糖转化实验，以确定最适反应温度及pH值，然后利用HPLC分析反应物中海藻糖含量（占总糖的百分比），结果如图4、5所示。

图4 反应温度对酶活的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on enzymatic activity

图5 pH值对酶活的影响Fig.5 Effect of pH value on enzymatic activity

由图4可看出，当反应温度在25～35℃时，重组酶的活性随反应温度的升高而上升，当反应温度超过35℃后，重组酶的活性逐渐下降。说明重组酶在35℃时转化率最高。

由图5可看出，当pH值在6.5～8.0时，重组酶的活性随pH值的增大而上升，当pH值大于8.0后，重组酶的活性逐渐下降。说明重组酶在酸性至中性条件下转化率较高，在pH值为8.0时转化率最高。

以上结果表明：重组酶在35℃和pH值为8.0时活性最高，生成海藻糖最多，此时的转化率约为67%。

3 结论

采用PCR法，以D.wulumuqiensis R12基因组DNA为模板，克隆出分子量约1 700bp的海藻糖合成酶基因treS，将其与T载体连接，并转化E.coli DH5α获得重组子，涂布划线后进行菌落PCR扩增。然后经IPTG诱导表达得到约66kDa的目的蛋白。经酶活测定，诱导表达的重组海藻糖合成酶能将麦芽糖一步催化成海藻糖。以30%麦芽糖为底物进行海藻糖转化实验，结果显示，该海藻糖合成酶在35℃、pH值为8.0时催化效率最高，转化率达到67%。

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