柱前衍生HPLC 法分析蔓菁多糖中单糖的组成

邝婷婷， 王 宇， 王 张 ， 杨永东， 张 艺

(成都中医药大学民族医药学院，四川 成都611137)

蔓菁为十字花科芸薹属植物芜菁Brassica rapa L. 的干燥块根，味甘，性温，能祛风、生赤巴、滋补、解毒，治培根病、龙病、身体虚弱、中毒病［1-2］。现代研究发现，蔓菁提取物具有抗缺氧、提高免疫力、抗辐射等活性［3-8］。多糖是一类免疫活性物质，具有提高免疫能力的作用，广泛存在于植物中。前期药理实验证明，蔓菁多糖具有缓解小鼠体力疲劳和提高耐缺氧能力的作用［9］。因此，本实验采用柱前衍生化反相高效液相色谱法对蔓菁多糖进行单糖组成方面的研究，旨在为蔓菁多糖药理活性方面的深入研究和保健品深度开发提供可靠依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200 型HPLC 色谱仪，Agilent Chemstaiton 工作站(美国Agilent 公司);HK-04B型中药粉碎机(广州华凯机电设备有限公司);TDZ5-WS 多管架自动平衡离心机(湘南湘仪实验室仪器开发有限公司);Sartorius BP121s 电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);超纯水器(ULUP-1-10T 型，成都超纯科技有限公司)，超声波清洗器(CQ-250 型，上海必能信公司);Finnpipette 白色微量移液器(热电上海公司);尼龙有机滤头(0.45 μm，津腾公司);Labconco FreeZone冷冻干燥仪(美国LABCONCO 公司)。

1.2 材料 蔓菁药材来源于四川省白玉县章都乡马拉村，经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为十字花科芸薹属植物芜菁Brassica rapa L.的干燥块根。半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸对照品纯度均在99.0%以上，购于中国药品生物制品检定检验所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂;苯酚、95%乙醇、浓硫酸为分析纯，购自成都市科龙化工仪器厂;水为实验室自制去离子水;乙腈、磷酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 参照文献［10-11］的方法，略有改进。Kromasil C18色谱柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm);乙腈为A 流动相，0.1 mol/L 磷酸盐(KH2PO4-NaOH，pH 6.8)缓冲液为B 流动相，梯度洗脱(0 ～10 min，16%A;10 ～30 min，16% ～18%A;30 ～50 min，18% ～19% A);检测波长250 nm;体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL;柱温30 ℃。

2.2 蔓菁多糖的提取 蔓菁样品干燥粉碎(过三号筛)，取粉末约6 g，精密称定，加80%乙醇回流提取2 次，滤渣晾干，加30 倍量水，90 ℃水浴回流提取3 次，每次2 h，合并滤液，浓缩至料液比1 ∶1，加乙醇使乙醇体积分数为80%，静置24 h。离心弃去上层清液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤至无色，再加水复溶，复溶液中加相当于其体积1/4 的sevag 试剂，剧烈振摇，离心，取上层清液再加相当于其体积1/4 的sevag试剂，重复以上操作直到无白色絮状物产生为止;所得上层清液，加3% 的活性炭，60 ℃吸附40 min，滤过，离心，取上层清液，浓缩，真空冷冻干燥，即得蔓菁多糖。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液 取蔓菁多糖约20 mg，精密称定，置20 mL 具塞试管中，加2 mol/L 硫酸溶液

2.0 mL，在沸水浴中水解8 h，用8 mol/L NaOH 中和至约pH 7，用水稀释至5 mL，离心，收集上层清液，即得。

2.3.2 对照品溶液 分别称取半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中用水溶解并定容至刻度，摇匀，配制成含半乳糖791 μmol/L、D-甘露糖500 μmol/L、鼠李糖305 μmol/L、阿拉伯糖1 316 μmol/L、D-无水 葡 萄 糖1 124 μmol/L、D-葡 萄 糖 醛 酸 155 μmol/L、D-半乳糖醛酸1 198 μmol/L 的对照品溶液，备用。

2.4 衍生化产物的制备 参照文献［12-13］的方法，略有改进。将单糖对照品、混合对照品溶液及蔓菁多糖水解样品溶液各取200 μL 分别置于10 mL离心管中，然后向其依次加0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各200 μL 和0.3 mol/LNaOH 溶液200 μL，混匀后置于70 ℃水浴中加热反应30 min，取出放置至室温;再加0.3 mol/L 盐酸溶液200 μL 中和，混匀后加1 mL 三氯甲烷涡旋混合，静置，弃去下层液，重复3 次，上层液过0.45 μm 微孔滤膜，取10 μL 进样，进行HPLC 分析。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系 分别精密吸取上述混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为系列对照品混合溶液。按“2.4”项下色谱条件进样，记录色谱图。以对照品浓度(X)为横坐标，色谱峰峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，结果见表1。

表1 7 种单糖衍生产物的线性关系Tab.1 Linear relationship for precolumn derivation product of seven monosaccharide

2.5.2 精密度试验 取对照品混合溶液，按“2.4”项下进行衍生化，依照“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，测定半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸峰面积的RSD 分别为0.5%、0.6%、0.5%、0.4%、0.5%、0.3%和1.1%。

2.5.3 重复性试验 取蔓菁多糖6 份，按“2.3”项下操作制备溶液，再按“2.4”项下方法进行衍生化处理，在“2.1”项色谱条件下，进行测定，记录峰面积，计算半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸含有量的RSD 分别为1.3%、1.1%、1.7%、1.9%、1.7%、1.2%和0.8%。

2.5.4 稳定性试验 取蔓菁多糖，按“2.3”项下操作制备溶液，再按“2.4”项下方法进行衍生化处理，分别于衍生化反应结束后0、2、4、8、16 和24 h 进样，记录峰面积，结果表明样品溶液在24 h 内稳定，半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸峰面积的 RSD 分别为1.2%、1.3%、1.4%、1.3%、1.8%、1.7%和1.2%。

2.5.5 加样回收率试验 取已知含有量的蔓菁多糖约0.01 g，共6 份，精密称定，置具塞试管中，分别精密加入不同量的半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸对照品适量，按“2.3.1”项下操作制备溶液，再按“2.4”项下方法进行衍生化处理，在“2.1”项色谱条件下，进行测定，结果见表2 ～表8。

表2 半乳糖加样回收试验结果Tab.2 Results of recovery tests for galactose

2.6 样品测定 取蔓菁多糖6 份，按“2.3”项下操作制备溶液，再按“2.4”项下方法进行衍生化处理，在“2.1”项色谱条件下进行测定，记录峰面积。根据分析和计算，求得蔓菁多糖中半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸摩尔比为1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17，色谱图见图1。

表3 D-甘露糖加样回收试验结果Tab.3 Results of recovery tests for mannose

表4 鼠李糖加样回收试验结果Tab.4 Results of recovery tests for rhamnose

表5 阿拉伯糖加样回收试验结果Tab.5 Results of recovery tests for arabincose

表6 D-无水葡萄糖加样回收试验结果Tab.6 Results of recovery tests for glucose

表7 D-葡萄糖醛酸加样回收试验结果Tab.7 Results of recovery tests for glucuronic acid

表8 D-半乳糖醛酸加样回收试验结果Tab.8 Results of recovery tests for galacturonic acid

图1 对照品(A)与样品衍生产物(B)色谱图Fig.1 Chromatograms of standards (A)and sample precolumn derivation products (B)

3 讨论

3.1 多糖水解时间的选择 本实验考察了蔓菁多糖完全水解所需时间及不同水解时间内单糖摩尔比的变化趋势。结果表明，水解2、4、6、8 h 所得到的7 种单糖摩尔比呈上升趋势，水解8 h 和10 h所得到的7 种单糖摩尔比是一致的，故选择水解时间是8 h。

3.2 衍生化条件的影响 从对照品与样品衍生产物色谱图可知，衍生化后的杂质峰出现在20 min之前，可与各个单糖衍生物的峰很好地分离，不影响单糖组分的测定。由1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的空白实验可知，残留的PMP 峰出在17.5 min，可与各个单糖很好地分离，其残留不影响单糖的测定。

3.3 本实验采用PMP 柱前衍生化HPLC 法分析蔓菁多糖中各单糖组分，结果表明蔓菁多糖由半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸7 种单糖组成，其摩尔比为1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17。其中半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比含有量明显高于葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖，其摩尔比百分比达到78.7%，说明蔓菁多糖主要由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖构成，其中半乳糖醛酸的摩尔比最大。由此可见，半乳糖醛酸在蔓菁多糖中含有量最高。

本实验建立的PMP 柱前衍生化高效液相色谱法分析单糖的方法准确可靠，可同时检测7 个单糖，且分离效果理想，适合于蔓菁多糖样品的单糖组成测定，所得到的结果从侧面反映了蔓菁多糖的结构。

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