药用植物内生菌对青藤碱的微生物转化筛选

刘发贵，潘 烨，邓艾平，罗 丹，杨 进，郭志勇，邓张双

三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室，宜昌 443002

青藤碱(Sinomenine)是一种天然吗啡烷类生物碱，拥有抗炎、免疫调节、镇痛、抗肿瘤、降血压、促组胺释放、神经保护等多种药理活性，临床用于类风湿性关节炎的辅助治疗［1］。但是，青藤碱分子结构对光、热、碱不稳定，且生物利用度低，易引起肠胃不适等副作用，限制了青藤碱作为抗炎药物的应用［2］。为了克服这些缺陷，国内外学者对青藤碱分子进行了化学结构修饰，却很少发现抗炎活性突出的青藤碱衍生物［3］。生物转化反应具有反应条件温和、反应产物立体选择性好、较易获得结构新颖的化合物等特点;同时符合生物体代谢规律，发现具有生理活性的代谢产物几率高［4］。

关于青藤碱的生物转化研究国内外报道较少。陈磊［5］报道了真菌Cunninghamella M2 转化青藤碱为羟基青藤碱，但是没有给出转化产物的结构式。课题组在前期研究过程中，发现真菌Antrodiella semisupina 能催化青藤碱和愈创木酚形成碳碳和碳氧交叉偶联产物1 和2［6］，且能选择性的催化青藤碱及类似物转化为(S)-双青藤碱类结构3 和4［6-8］。Joyeau Roger 等［9］人发现青藤碱衍生物O-benzyl-sinomenine 能被真菌Mucor plumbeus ATCC 4740 转化成去氮甲基产物5 和氮氧化物6 两种转化产物。课题组借鉴前期研究经验，继续研究青藤碱的微生物转化反应及转化产物，本文以药用植物内生菌为研究载体，建立青藤碱的微生物转化筛选模型，研究青藤碱与内生菌共培养以后的代谢产物，以期发现具有高效抗炎效果或者结构新颖的青藤碱衍生物。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

青藤碱盐酸盐:购自成都钜龙天然药业生命科技有限公司，经HPLC 分析，纯度≥97.0%。GF254薄层层析硅胶板(20 mm × 20 mm，0.25 mm)和正相硅胶(300～400 目)均购自青岛海洋化学有限公司。薄层层析条件:CHCl3-CH3OH(9∶1，V/V)，254 nm 紫外显色。分析试剂均为色谱纯，常规试剂均为分析纯。

图1 青藤碱微生物转化产物Fig.1 Chemical structures of sinomenine and its biotransformed products

1.2 仪器

1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HMQC 和HMBC 谱由Bruker Avance III-400 核磁共振仪测得，溶剂为CDCl3，内标为四甲基硅烷(Tetramethylsilane，TMS)，化学位移记为δ(ppm);化合物分子量由液相色谱-双重漏斗传输离子阱质谱仪(仪器型号为AmozonSL+1200，布鲁克.道尔顿公司)测得;微生物培养在恒温摇床HQD150LB(武汉海声达仪器设备有限公司)上进行。

2 实验方法

2.1 植物组织

采自湖北省神龙架林区，分别为青风藤［Sinomenium acutum(Thunb)Rehd.et Wils.］、夹竹桃(Nerium oleander)、朵 云(Botrychium daucifoltum Woll)、蛇菰(Balanophora japonica)，由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室杨进副教授鉴定。

2.2 斜面培养基(SPM)

将200 g 去皮土豆切成小块，加适量水煮沸30 min，用纱布过滤，滤液中加入琼脂30 g，煮沸，加入葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，微量维生素B1，调节pH 至6.0，定容至1 L，用试管分装(约10 mL/1 支试管)，在121 ℃下灭菌20 min。

2.3 微生物转化培养基(SPM)

将200 g 去皮土豆切成小块，加适量水煮沸30 min，用纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，微量维生素B1，调节pH 至6.0，定容至1 L，用250 mL 锥形瓶分装(约100 mL/1 个锥形瓶)，在121 ℃下灭菌20 min。

2.4 菌株分离

取部分植物组织放入75%左右的酒精溶液(含少量抗生素)中荡洗，接入含抗生素的PDA 平板中，倒置培养，观察并做好记录，待菌落开始萌发时，将单个菌落转入PDA 平板上继续培养、分离纯化，并进行斜面保种。

2.5 转化菌株筛选

活化7 d 的斜面菌种，转接到100 mL 发酵培养基中，恒温振荡器上培养4 d(25 ℃，150 rpm)，利用无菌滤膜加入青藤碱盐酸盐水溶液1 mL(20 mg/mL)，同样条件下继续培养4 d，停止培养。将发酵液过滤，滤液用NH3·H2O 调节pH 值至10.0，接着用CH2Cl2萃取(100 mL × 3)，合并萃取液，无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸干溶剂，得固体粉末。用少量CHCl3溶解，在GF254薄层层析硅胶板上以一定间距点样，展开剂为CHCl3-CH3OH(9∶1，V/V)，254 nm 紫外灯下检测，观察紫色斑点位置及大小，确定是否存在转化。同样条件下，分别以培养过程中不添加青藤碱和不接入菌种作为空白对照。

2.6 转化产物的制备

活化7 d 的斜面菌种，转接到200 mL 的发酵培养基(SPM)中，恒温振荡器上培养4 d(25 ℃，150 rpm)，利用无菌滤膜加入青藤碱盐酸盐水溶液1 mL(20 mg/mL)，同样条件下继续培养4d，停止培养。将发酵液过滤，滤液用NH3·H2O 调节pH 值至10.0，接着用CH2Cl2萃取(200 mL × 3 × 10)，合并萃取液，无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸干溶剂，得固体粉末。经硅胶层析柱、HPLC 半制备柱分离，得转化产物。

3 结果与分析

3.1 青藤碱生物转化菌株的筛选

从青风藤［Sinomenium acutum(Thunb)Rehd.et Wils.］、夹竹桃(Nerium oleander)、朵云(Botrychium daucifoltum Woll)、蛇菰(Balanophora japonica)四种植物组织中利用传统的划线分离方法共分得植物内生菌84 株，保藏在天然产物研究与利用湖北省重点实验室微生物菌种库，暂未做鉴定。采用PDY 液体发酵方式，将青藤碱与84 株菌株分别进行共培养，筛选出7 株具有青藤碱转化能力的微生物菌株，菌株编号分别为JZT01、JZT11、DY10、SD04、SD06、BY09、Q08。其转化产物经薄层色谱分析(图2)，7株菌株在青藤碱转化能力上大致分为四种类型:(1)菌株Q08 具有完全转化青藤碱的能力，且转化产物单一，经TLC 分析初步鉴定为(S)-disinomenine;(2)菌株JZT11 和DY10 具有完全降解青藤碱的能力，青藤碱被代谢成小分子后可能作为碳、氮源被微生物生长所消耗;(3)菌株SD06、SD04 和BY09 具有部分转化青藤碱的能力。这三株菌株与青藤碱共培养4 d 后，青藤碱并未完全转化成代谢产物，经TLC 分析，初步鉴定转化产物均为(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，其中(S)-disinomenine 为主要产物;(4)菌株JZT01 具有较弱的青藤碱转化能力，经TLC 分析，转化产物非(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，可能是一种具有新结构的代谢产物。但是，该菌株代谢青藤碱的酶活较低，如何通过代谢调控提高酶活力，从而加速青藤碱的转化速度，将是课题组后续努力方向之一。

3.2 青藤碱生物转化产物的分离与结构鉴定

图2 青藤碱转化产物薄层色谱(TLC)分析Fig.2 TLC analysis of sinomenine and its metabolites

为了进一步确认菌株SD06、SD04 和BY09 转化青藤碱的产物为(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，选取菌株SD04 进行放大培养，加入青藤碱盐酸盐总计530 mg，共获得转化产物粗提物600 mg，经硅胶层析柱吸附，CH2Cl2-CH3OH(9∶1，V/V)淋洗，得转化产物S1(250 mg，产率50%，按青藤碱加入量计算)，转化产物S2(100 mg，产率20%，按青藤碱加入量计算)。对菌株SD04 与青藤碱共培养的转化产物经过系统分离及NMR 鉴定，确定青藤碱被真菌SD04 转化为两种代谢产物S1 和S2，分别为(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine。

化合物S11H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.27(s，1H)，6.26(brs，1H)，5.45(d，J=1.7 Hz，1H)，4.41(d，J=15.5 Hz，1H)，3.75(s，3H)，3.52(s，3H)，3.09(t，J=4.0 Hz，1H)，3.06(brs，1H)，2.56(dd，J=2.6，11.8 Hz，1H)，2.49(d，J=15.6 Hz，1H)，2.43(dd，J=5.4，18.8 Hz，1H)，2.34(s，3H)，2.33(d，J=18.8 Hz，1H)，2.19(td，J=2.8，11.9 Hz，1H)，2.03(d，J=12.3 Hz，1H)，1.93(dd，J=4.4，12.8 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.9，152.4，144.8，143.7，130.5，127.7，123.2，115.0，110.6，56.2，55.9，54.7，49.2，47.1，45.7，42.9，40.8，35.8，23.8;ESI-MS m/z 657［M +H］+。NMR 数据与文献［6］对照，鉴定化合物S1 为(S)-disinomenine。

化合物S21H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.44(s，1H)，5.30(brs，1H)，4.43(d，J=15.7 Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.52(s，3H)，3.02-2.94(m，2H)，2.60-2.42(m，3H)，2.30(s，3H)，2.12-1.96(m，2H)，1.90(td，J=4.2，12.4 Hz，1H)，1.77(dd，J=5.0，18.8 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.8，152.3，145.0，143.9，130.8，128.0，123.1，114.7，109.4，56.2，56.0，54.3，49.1，47.2，45.5，43.0，40.6，35.6，22.5;ESI-MS m/z 657［M+H］+。NMR 数据与文献［6，7］对照，鉴定化合物S2 为(R)-disinomenine。

菌株JZT01 与青藤碱共培养(0.15 mg/mL)5 d后得发酵液4 L，经调碱、萃取得浸膏200 mg，硅胶层析柱分离得转化产物S3(5 mg，产率0.8%，按青藤碱加入量计算)。

化合物S3 淡黄色，无定型粉末，分子式为C19H23NO5，分子量与青藤碱相比，增加16。化合物1H NMR 显示化合物S3 含有22 个质子信号(未见苯环羟基质子信号)，包括2 个偶联的芳基质子信号δ 6.70(d，J=8.4 Hz，1H)和δ 6.54(d，J=8.4 Hz，1H);1 个烯烃质子信号δ 5.38(d，J=2.0 Hz，1H);2 个甲氧基质子信号δ 3.83 (s，3H)和δ 3.49(s，3H);1 个氮甲基质子信号δ 3.290(s，3H);联合质子偶联常数及HMQC 谱可分辨4 个亚甲基质子信号δ 1.86(d，J=13.2 Hz，1H)和δ 2.67(dd，J=4.4，13.2 Hz，1H)，δ 2.60(d，J=15.2 Hz，1H)和δ 4.37(d，J=15.2 Hz，1H)，δ 2.89(td，J=3.2，12.4 Hz，1H)和δ 3.12(dt，J=2.0，12.4 Hz，1H)，δ 3.06(d，J=19.2 Hz，1H)和δ 3.293(dd，J=5.6，19.2 Hz，1H);2 个次甲基质子信号δ 4.39(brs，1H)和δ 3.67(t，J=4.4 Hz，1H)。13C NMR 显示化合物S3 含有19 个碳信号，包括2 个苯环烯碳信号δ 118.5 和δ 113.1;1 个烯碳信号δ 109.9;2 个次甲基碳信号δ 73.4 和δ 38.9;3 个甲基碳信号δ 58.2、56.2 和55.0;4 个亚甲基碳信号δ 61.3、47.7、31.6 和29.1;7 个季碳信号。与青藤碱分子NMR 谱图相比，可见9、14、16 和17 位的质子信号和碳信号明显移向低场，其他碳氢信号与青藤碱基本一致，说明在这4 个位置的中心碳原子上插入了杂原子。结合上面数据分析，可以推测在基团NCH3的氮原子上插入了氧原子，形成了N 氧化物。NMR 数据与文献［10］对照，鉴定化合物S3 为sinomenine N-oxide。

化合物S31H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 6.70(d，J=8.4 Hz，1H)，6.54(d，J=8.4 Hz，1H)，5.38(d，J=2.0 Hz，1H)，4.39(brs，1H)，4.37(d，J=15.2 Hz，1H)，3.83(s，3H)，3.67(t，J=4.4 Hz，1H)，3.49(s，3H)，3.293(dd，J=5.6，19.2 Hz，1H)，3.290(s，3H)，3.12(dt，J=2.0，12.4 Hz，1H)，3.06(d，J=19.2 Hz，1H)，2.89(td，J=3.2，12.4 Hz，1H)，2.67(dd，J=4.4，13.2 Hz，1H)，2.60(d，J=15.2 Hz，1H)，1.86(d，J=13.2 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.0，152.7，146.0，145.2，125.4，121.2，118.5，113.1，109.9，73.4，61.3，58.2，56.2，55.0，47.7，39.4，38.9，31.6，29.1;ESI-MS m/z 345.9［M +H］+。

4 结论

本文建立了药用植物内生菌对青藤碱的生物转化模型，利用薄层色谱(TLC)及NMR 技术对转化产物进行了结构确认，为(S)-disinomenine、(R)-disinomenine 和sinomenine N-oxide。所得微生物对青藤碱的转化多以双青藤碱为唯一类型的转化产物，这可能与青藤碱的刚性结构及4 位羟基有关。青藤碱的刚性结构可能阻碍了与微生物酶的结合，而青藤碱4 位羟基易被微生物体内的氧化酶氧化形成偶联产物，双青藤碱的形成进一步加剧底物与酶的结合位阻，多方面的原因导致转化产物结构类型单一。为了获得结构丰富的微生物转化产物，在共培养过程中，加入氧化酶抑制剂或者改变底物结构(如保护青藤碱4 位羟基)将是我们以后的研究方向。Sinomenine N-oxide 首次报道见于2005 年秦国伟教授等人从植物Sinomenium acutum 中分离得到，青藤碱在H2O2存在的条件下，也会发生氧化反应生成该化合物［10］。课题组在前期的研究过程中，发现邻苯二胺能诱导真菌Antrodiella semisupina 转化青藤碱为Sinomenine N-oxide，其生成机制不明确［11］。本文发现了一种真菌与青藤碱共培养，在无任何诱导剂存在的情况下，可以直接氧化青藤碱为Sinomenine N-oxide，可为氮氧化物合成酶及类似酶促反应提供一定参考价值。

1 Wang QX，Li XK.Immunosuppressive and anti-inflammatory activities of sinomenine.Int Immunopharmacol，2011，11:373-376.

2 Lou YT，Zhou HB，Zou J，et al.Modification of poorly bioactive sinomenine into more potent immunosuppressive agents by embedding of drug-like fragments.Tetrahedron Lett，2010，51:485-488.

3 Xiao J(肖靓)，Deng ZS(邓张双)，Li JX(李建新)，et al.Sinomenine based molecular design of anti-RA agents.J Huazhong Normal Univ，Nat Sci(华中师范大学学报，自科版)，2009，43:83-91.

4 Bruce NC，Boonstra B，Rathbone DA.Engineering novel biocatalytic routes for production of semisynthetic opiate drugs.Biomol Eng，2001，18(2):41-47.

5 Chen L(陈磊)，Liu Y(刘怡)，Lu JQ(卢建秋)，et al.Synthesis of hydroxy-sinomenine by microbial transformation and optimization of its transformation conditions.J Beijing Univ TCM (北京中医药大学学报)，2008，31:702-704.

6 Deng ZS，Li JX，Teng P，et al.Biocatalyzed cross-coupling of sinomenine and guaiacol by Antrodiella semisupina.Org Lett，2008，10:1119-1122.

7 Deng ZS，Zhao Y，He CC，et al.pH-Dependent，stereoselective dimerization of sinomenine.Org Lett，2008，10:3879-3882.

8 Teng P，Liu HL，Deng ZS，et al.Synthesis and biological evaluation of unique stereodimers of sinomenine analogues as potential inhibitors of NO production.Bioorg Med Chem，2011，19:3096-3104.

9 Joyeau R，Planchon M，Abessolo J，et al.Combinatorial approach to the selection of active microorganisms in biotransformation:Application to sinomenine.J Mol Catal B-Enzym，2013，85-86:65-70.

10 Bao GH，Qin GW，Wang R，et al.Morphinane alkaloids with cell protective effects from Sinomenium acutum.J Nat Prod，2005，68:1128-1130.

11 Xiao L(肖靓)，Deng ZS(邓张双)，Li JX(李建新)，et al.Induced biotransformation of sinomenine by phenylenediamine.J Huazhong Univ of Sci ＆ Tech，Nat Sci(华中科技大学学报，自科版)，2009，37(8):125-128.