决明子生品及炮制品的抗氧化活性研究

孔祥密，王培卿，康文艺

河南大学中药研究所，开封 475004

决明子为豆科草本植物决明(Cassia obtusifolia L.)或小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子。其味甘、苦、咸，性微寒，归肝、肾、大肠经，具有清肝明目、润肠通便的功效［1］。在中国传统医学上用于保护肝脏［2］，此外还用于治疗目赤肿痛、羞明泪多、头痛头晕、大便秘结。现代药理学研究证明，决明子具有降血压、降血脂、抗氧化、抗菌等活性［3］，是一种被广泛应用的药用同源的植物。化学研究表明，萘并吡喃酮类和蒽醌类化学物质是决明子的主要药效成分［4］。至今研究显示决明子提取物可以抑制活性氧自由基活性，消除羟自由基，在细胞和细胞膜中与脂类结合而有效抑制脂质的氧化过程［5］。郑荣波，黄晓丹等［6］研究了决明子提取物对链脲佐菌素诱发糖尿病小鼠晶状体氧化应激状态的影响，发现决明子提取物可以通过清除自由基和抑制脂质过氧化过程改善STZ 诱导糖尿病小鼠晶状体内的过氧化状态，说明决明子具有一定的抗氧化能力。本课题组采用DPPH、ABTS 和FRAP 三种方法对决明子及其炮制品的抗氧化活性进行了综合考察，以评价不同炮制方法对决明子抗氧化作用的影响。

1 仪器、材料与试剂

1.1 主要仪器

UV-2000 型紫外可见分光光度计(上海尤尼可仪器有限公司);旋转蒸发仪(日本东京理化公司);电子天平(美国Mettler-Toledo 仪器有限公司);Multiskan MK3 酶标仪(美国Thermo Electron 公司)。

1.2 材料

决明子购于开封乐仁堂总店，经河南大学中药研究所李昌勤副教授鉴定为豆科草本植物决明(Cassia obtusifolia L.)或小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子，标本存于河南大学中药研究所。

1.3 试剂

DPPH(日本东京化成工业株式会社);［2，2'-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐］(ABTS，美国Fluka 公司);Fe3+-三吡啶三哑嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ;比利时Acrosorganics 公司);6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox，美国Aldrich 公司);二丁基羟基甲苯(BHT，比利时Acros organics 公司);其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 决明子炮制及浸膏提取

决明子生品:决明子原药材除去杂质，洗净后干燥;炒决明子:取净决明子500 g，置于锅内用中火，炒至颜色加深，断面浅黄色，爆鸣声减弱并有香气溢出是，取出放凉;盐决明子:取净决明子500 g，加盐水(2 kg/100 kg)，拌匀闷透，置于锅内用文火加热，炒至表面棕褐色，微鼓起，有香气溢出，取出放凉;酒炙决明子:取净决明子500 g，加入适量黄酒浸泡过夜，置于锅内用文火炒干，取出放凉;醋炙决明子:取净决明子500 g，加入适量米醋浸泡过夜，置于锅内用文火炒干，取出放凉;酒蒸决明子:取净决明子500 g，加入适量黄酒浸泡过夜，恒温55 ℃蒸2 h，取出放凉。

各取决明子生品、炒决明子、盐决明子、酒炙决明子、醋炙决明子和酒蒸决明子200 g，用甲醇冷浸提取三次，回收溶剂，得甲醇总浸膏。甲醇总浸膏用10%甲醇水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到决明子生品及5 种炮制品各石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

2.2 抗氧化活性筛选

2.2.1 DPPH 法

按照文献［7］的方法，在515 nm 波长处测定样品及对照品BHT 对DPPH 自由基的清除能力。计算清除率及半数抑制率IC50值。

2.2.2 ABTS 法

按照文献［8］的方法，在734 nm 波长处测定样品及阳性对照BHT 对ABTS 自由基的清除能力。计算清除率及半数抑制率IC50值。

2.2.3 FRAP 法

按照文献［9］的方法，在593 nm 波长处测定样品及阳性对照BHT 还原Fe3+的能力，结果以Trolox 当量表示。当C(Trolox)=25～400 mol/L 时，有良好的线性关系(r=0.9996)。

3 结果与分析

3.1 对DPPH 自由基的清除能力

表1 显示，除酒炙、酒蒸和盐蒸决明子EA 部位外其他决明子生品及其炮制品提取物均无清除DPPH 自由基的作用，酒炙、酒蒸和盐蒸决明子EA 部位清除DPPH 自由基的能力(IC50分别为94.4、93.8 和104.6 μg/mL)远弱于阳性对照BHT(IC50为23 μg/mL)。

注:BHT 为阳性对照品。Note:BHT was used as positive control.

图1 炒决明子(A)、醋炙决明子(B)、酒蒸决明子(C)、酒炙决明子(D)、决明子生品(E)及盐蒸决明子(F)各部位对ABTS自由基的影响Fig.1 Scavenging activities of different concentrations of fried(A)，vinegar fried(B)，wine steamed(C)，wine fired(D)，raw(E)and salt steamed(F)C.obtusifolia on ABTS free radical

3.2 对ABTS 自由基的清除作用

决明子及其炮制品提取部位的质量浓度对ABTS 自由基的清除率的影响见图1(A)～(F)。结果显示，决明子生品及其炮制品各提取部位对ABTS自由基的清除率随着质量浓度的增加而增大。除炒决明子ME 总浸膏、醋炙决明子各提取部位、酒蒸决明子PE 部位、酒炙决明子PE 及ME 部位、决明子生品BU 及PE 部位和盐蒸决明子ME 总浸膏外，其他部位当达到一定浓度后，再继续增加浓度，抑制率变化不大，即抗氧化活性接近饱和。

由表1 可以看出，决明子及其炮制品清除ABTS自由基的能力都弱于阳性对照BHT(IC50为2.3 μg/mL)。炒决明子、醋炙决明子和酒炙决明子PE 部位清除ABTS 自由基的能力(IC50分别为11.1、43.1 和47.1 μg/mL)强于决明子生品PE 部位(IC50为60.7 μg/mL);酒炙决明子和盐蒸决明子EA 部位清除ABTS 自由基能力(IC50分别为8.1 和9.7 μg/mL)均强于决明子生品EA 部位(IC50为10.5 μg/mL);炒决明子、酒炙决明子、酒蒸决明子和盐蒸决明子清除ABTS 的能力(IC50分别为11.7、13.7、15.3 和9.7 μg/mL)均强于决明子生品BU 部位(IC50为29.9 μg/mL)。

3.3 对Fe3+的还原能力

表1 显示，决明子生品及炮制品各提取部位还原Fe3+的能力均弱于阳性对照BHT，炮制后的决明子ME 部位还原Fe3+的能力均降低;炒决明子、醋炙决明子和酒炙决明子PE 部位Fe3+的还原能力(TEAC 分别为208.85、50.3 和69.47 μmol/g)强于决明子生品PE 部位(TEAC=28.88 μmol/g);酒炙、酒蒸和盐蒸决明子EA 部位Fe3+的还原能力(TEAC 分别为319.22、298.49 和290.92 μmol/g)强于决明子生品EA 部位(TEAC=195.59 μmol/g);炒炙、醋炙、酒炙、酒蒸及盐蒸决明子BU 部位Fe3+的还原能力(TEAC 分别为120.96、47.87、152.88、175.23 和217.56 μmol/g)强于决明子生品BU 部位(TEAC=44.89 μmol/g)。

4 结论

本文首次采用DPPH、ABTS 和FRAP 3 种抗氧化方法，对决明子及其5 种炮制品不同提取部位进行研究，结果表明，决明子及其炮制品的抗氧化活性较弱，均低于阳性对照BHT。与生品相比，经炮制后的决明子的抗氧化能力均发生了变化，此外，各部位的活性均与浓度呈正相关性，具有一定的浓度依赖性。

1 China Pharmacopoeia Committee(国家药典委员会).Pharmacopoeia of People's Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:Chemical Industry Press，2005.98.

2 Kang WY，Yu HL，Wang JX.α-Glucosidase inhibitory compounds from seeds of Cassia obtusifolia.Chem Nat Comp，2012，48:465-466.

3 Mei QX(梅全喜).Modern Pharmacology and Clinical Application Manual(现代中药药理与临床应用手册)，Beijing:China Press of Traditional Chinese Medicine，2008.232-233.

4 Zhang QW(张启伟)，Yin J(阴健)，Zhang J(张俊).Comparison of contents of some active components between crude and processed seeds of Cassia tora and their decoctions by HPLC.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，1996，27(2):79-81.

5 Ju MS，Kim HG，Choi JG，et al.Cassiae semen，a seed of Cassia obtusifolia，has neuroprotective effects in Parkinson's disease models.Food Chem Toxicol，2010，48:2037-2044.

6 Zheng RB(郑荣波)，Huang XD(黄晓丹)，He RR(何荣荣)，et al.Effects of Cassia obtusifolia extract on oxidative stress status in STZ-induced diabetic mice.Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志)，2012，18:233-237.

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8 Kang WY，Wang JM.In vitro antioxidant properties and in vivo lowering blood lipid of Forsythia suspense leaves.Med Chem Res，2010，19:617-628.

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