响应面优化柚皮苷制备根皮乙酰苯-4' -新橘皮糖苷工艺

刘燕青 ，程 凯，王严飞，刘 松，单 燕，余 勃，陆 豫*

1南昌大学药学院，南昌 330006;2 南昌大学中德联合研究院，南昌 330047

柚皮苷属于天然黄酮类化合物［1］，主要存在于芸香科植物柚的未成熟果实，它是工业化合成新橙皮苷二氢查尔酮(NHDC)的原料，研究表明NHDC具有强烈的甜味，口感清爽，余味持久，具有极强屏蔽苦味的功效，与其他甜味剂相比具有:甜度高、热量低、甜味慢、时间长、稳定性好、无毒性。对于当今越来越重视健康的社会群体，具有相当大的前景［2-5］。

1973 年Robertson 及其合作者报道了以柚皮苷为原料，大批量生产NHDC，其分三步进行操作:第一步制备根皮乙酰苯-4'-β-新橘皮糖苷(PN);第二步制备新橙皮苷;第三步制备NHDC［7］。在此过程中PN 是个关键的中间体。研究者在第一步做了大量的研究，但是产率只有34%［8］，关于第一步国内少有研究且还未有报道具体产率。本文采用了响应面试验设计，对水解柚皮苷制备PN 的工艺进行优化［9］，以提高PN 的产率。

1 仪器与材料

DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司);LC-15C 型高效液相(岛津)。

柚皮苷(西安鼎立生物工程有限公司提供，含量90%以上);PN 标准品自制(见“2.1”项);水、氢氧化钾、盐酸均为分析纯。

2 实验方法

2.1 PN 标准品的制备

三口瓶中加入KOH 溶液和柚皮苷，待柚皮苷完全溶解后，加热反应。反应一段时间停止反应，加入等体积水稀释，冷却至室温，用盐酸调pH=6.0 ±0.5，加热至75 ℃以上使沉淀溶解，置室温冷却结晶，减压抽滤，真空干燥，得粗品PN。取粗品用pH=6.0 ±0.5 的水加热至75 ℃以上溶解后至室温冷却结晶，抽滤;重复上述方法三次干燥得PN 标准品。

2.2 PN 色谱分析条件

色谱柱:Alltech Alltima Silica(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流动相∶乙腈∶水=15 ∶85;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:210 nm;进样量:20 μL。

2.3 PN 标准曲线制作

精确称取40 mg“2.1”项下制备所得PN 标准品于50 mL 容量瓶中，用适量的甲醇溶解后定容，摇匀，得0.8 mg/mL 的PN 标准溶液。取前一配好的PN 于另一50 mL 容量瓶中稀释至刻度，摇匀，以此类推，分别配得0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mg/mL PN标准品溶液。以PN 标准品浓度和HPLC 峰面积为纵坐标，得PN 标准曲线。

2.4 PN 产率计算

通过HPLC 检测，应用PN 标准曲线方程计算其含量，并用公式:产率(%)=实测PN 含量/PN 理论值×100%，计算各反应所得PN 产率。

2.5 PN 制备单因素实验

以KOH 为催化剂，选用了对产率有显著影响的五个因素，即水醇比、时间、碱浓度、温度、料液比，按照实验步骤以及产率计算方法，计算PN 产率。

2.6 响应曲面法优化

采用Box-Behnken 模型，以时间、碱浓度、温度、液料比、水醇比(V水/V乙醇)为主要的考察因子(自变量)，分别以X1、X2、X3、X4、X5表示，并以+1、0、-1 分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-X0)/ΔX 对自变量进行编码。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量真实值，ΔX 为自变量的变化步长，因子编码及水平见表1。

表1 实验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of response surface methodology

3 结果与分析

3.1 标准品PN 标准曲线方程及表征

HPLC 测按面积归一化法计算自制PN 标准品含量达 97.73%。制得标准曲线方程:y=0.030895x+0.923992，R2=0.9921。

图1 自制PN 标准品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of internal prepared PN standard

PN:黄白色固体，mp.156～165 °C;1H NMR(DMSO，600 MHz)δ:12.36(s，1H)，6.03(s，2H)，5.34(s，1H)，5.14(s，1H)，5.09(s，1H)，5.03 (d，J=7.2 Hz，1H)，4.68(s，2H)，4.51(s，2H)，3.69(m，3H)，3.43(m，6H)，3.35(m，2H)，3.22(m，2H)，2.59(s，1H)，1.15(d，J=7.8 Hz，3H);ESI-MS m/z(%):475.8(［M+H］-，50)。

3.2 单因素实验

3.2.1 水醇比对PN 产率的影响

固定时间为1.75 h，碱浓度为12.25%，温度为100 ℃，液料比为11.5∶1，考察溶剂对PN 产率的影响。从图2 可以看出，水醇比对PN 产率有显著的影响，水作为溶剂时达到最大值。

图2 水醇比对PN 产率的影响Fig.2 Effect of Water-alcohol ratio on PN yield

3.2.2 时间对PN 产率的影响

固定水醇比为1∶1，碱浓度为12.25%，温度为100 ℃，液料比为11.5∶1，考察时间对PN 产率的影响。从图3 可以看出，随着反应时间的延长产率提高比较显著，1.75 达到最大值。

图3 时间对PN 产率的影响Fig.3 Effect of the reaction time on PN yield

3.2.3 碱浓度对PN 产率的影响

固定水醇比为1∶1，时间为1.75 h，温度为100℃，液料比为11.5∶1，考察时间对PN 产率的影响。从图4 可以看出反应体系碱浓度增大，PN 的产率相应提高，当碱浓度为12.25%时达到最大值，随着碱浓度升高开始破坏PN 结构。

3.2.4 温度对PN 产率的影响

固定水醇比为1∶1，时间为1.75 h，碱浓度为12.25%，液料比为11.5∶1，考察温度对PN 产率的影响。从图5 可以看出，随着温度升高产率相应提高，当反应温度达到100 ℃时最大。

图4 碱浓度对PN 产率的影响Fig.4 Effect of the concentration of potassium hydroxide on PN yield

图5 温度对PN 产率的影响Fig.5 Effect of temperature on PN yield

3.2.5 料液比对PN 产率的影响

固定水醇比为1∶1，时间为1.75 h，温度为100℃，碱浓度为12.25%，考察温度对PN 产率的影响。从图6 可以看出，溶剂的量对PN 产率具有显著影响，当液料比在11.5∶1 时产率达到最大。

图6 液料比PN 产率的影响Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on PN yield

3.3 模型建立

表2 列出PN 产率的实测值及其预测值。

表2 实验设计及其结果Table 2 Experimental designs and results

实验号1～40 是析因试验，实验号41～46 是中心实验。零点为区域的中心点，零点实验重复六次，用以估计试验误差。利用Design Expert 软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得PN 产率对自变量之间的多元回归模型方程为方程(1)。

3.4 方差分析

该模型方差分析结果如表3 所示。

3.5 显著性检验

该模型系数显著性检验结果如表4 所示。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

表4 回归方程系数显著性检验Table 4 Test of significance for regression coefficient

采用软件对所得数据进行分析，回归分析见表3、4。当:“Prob ＞F”值小于0.05 时，既表示该项指标显著，表3 结果表明，对PN 产率所建立的回归模型是显著的(P ＜0.0001)，并且该模型的相关系数R=0.9898，校正决定系数AdjR2=0.9816 说明，此模型与实际试验拟合度较好，试验失拟项小，因此可用该回归方程代替真实点对实验结果进行分析。

3.6 PN 产率的响应面分析与优化

根据模型方程(1)所作的响应面图及其等高线图见图7(A～D)。通过该组动态图可评价实验因素对PN 产率的两两交互作用，以及确定各个因素的最佳水平范围。

图7 Y=f(x1，x2)(A)、Y=f(x2，x5)(B)、Y=f(x2，x3)(C)及Y=f(x3，x5)(D)的响应面Fig.7 Response surface plots of Y=f(x1，x2)(A)，Y=f(x2，x5)(B)，Y=f(x2，x3)(C)and Y=f(x3，x5)(D)

图7(A)显示了温度、液料比、水醇比位于中心点，即80.00、11.50、0.50 时，时间和碱浓度对PN 产率实测值的交互影响效应，等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反［10］。由图可以看出随着反应时间的延长，碱浓度的增大，PN 产率也随之升高。时间延长到2.00 h 产率达到最大，随后产率下降，说明随着2.00 h 之后产物开始被碱破坏，碱浓度在15%时达到最大，随后对产物的破坏加大，所以最佳反应时间是2.00 h，碱浓度为15%。

图7(B)显示了时间、温度、液料比位于中心点，即1.75、80.00、11.50 时，碱浓度和水醇比对PN 产率实测值的交互影响效应，由图可以看出随着碱浓度和水醇比的升高PN 产率也随之升高。碱浓度在15.00%时产率、纯水作为溶剂时产率最高。

图7(C)显示了时间、液料比、水醇比位于中心点，即1.75、11.50、0.50 时，碱浓度和温度对PN 产率实测值的交互影响效应，由图可以看出随着碱浓度和温度的升高PN 产率也随之升高。常压条件下反应温度在100 ℃时产率最高;碱浓度在15.00%时产率最高，所以最佳反应温度为100 ℃，碱浓度为15.00%。

图7(D)显示了时间、碱浓度、液料比位于中心点，即1.75、12.25、11.50 时，温度和水醇比对PN 产率实测值的交互影响效应，由图可以看出用水作溶剂最佳，温度在100 ℃时产率最高。

利用Design expert 软件，对方程(1)进行分析，求得PN 产率的最大预测值为69.76%，各主要因素的最佳反应条件为水作为溶剂，反应时间为2 h，碱浓度为15%(w/w)，温度为100 ℃，料液比为15(v/w)。对上述方程的合适性和有效性进行验证，开展了10 组验证实验，通过验证实验得到PN 产率的实测值和预测值相似。证明模型是合理有效的，具有一定的实践指导意义。

4 结论

本研究利用实验设计软件Design expert，首次通过响应面法建立了柚皮苷合成PN 的二次多项数学模型，经验证为合理有效的，同时对关键因子及其相互作用进行研究，确定出柚皮苷合成PN 最佳工艺条件为:水作为溶剂，反应时间为2 h，碱浓度为15%(w/w)，温度为100 ℃，料液比为15(v/w)。

1 Natarajan S，Eveleigh DE，Dawson RH.A nature source for neohesperidin.Econ Bota，1976，30(1):38-38.

2 Castillo J，Benavente O，Del rio JA，et al.Naringin and neohesperidin levels during development of leaves，flower buds，and fruits of citrus aurantium.Plant Physiol，1992，99:67-73.

3 Wen HL (温辉梁)，Ouyang ZY (欧阳振宇)，Hu XB (胡晓波)，et al.Research progress of neosperidin dihydrochalcone.China Cond (中国调味品)，2008，10:70-73.

4 Sun ZG (孙志高)，Huang XG (黄学根)，Jiao BN (焦必宁)，et al.Studied on the distributing of main bitter components in citrus fruit and the debittering technology of orange juice.Food Sci(食品科学)，2005，26:146-148.

5 Zheng JX (郑建仙).Functional Food Additive.Beijing:Chinese Light Industry Press(中国轻工业出版社)，1997.

6 del Rio JA，Ortuno A，Marin FR，et al.Bioproduction of neohesperidin and naringin in callus cultures of Citrus aurantium.Plant Cell Rep，1992，11:592-596.

7 Robertson GH，Clark JP，Lundin R.Dihydrochalcone sweeteners:preparation of neohesperidin dihydrochalcone.Ind Eng Chem Prod Res Dev，1974，13:125-129.

8 Ambati P，Ayyanna C.Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface method.World J Microbiol Biotechnol，2001，17:331-335.

9 Muralidhar RV，Chirumamila RR，Marchant R，et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources.Biochem Eng J，2001，9:17-23.

10 Krbechek L，Inglett GE，Holik M，et al.Dihydrochalcones.Synthesis of potential sweetening agents.J Agric Food Chem，1986，16:108-112.