南海软海绵Halichondria sp.化学成分研究

田永奇，甘建红，吴文惠*

上海海洋大学食品学院，上海 201306

海绵出现于寒武纪，是最原始、最简单的多细胞动物，分布极为丰富，自赤道到两极不同深度的海域都有海绵的存在。已知的海绵有1 万余种，其颜色、形状千姿百态，大小、质量相差非常大(直径1～15 m)。为了抵御外族的侵袭和恶劣的海洋环境，海绵群体在上亿年的积累中产生了很多化学防御物质。而这些化学防御物质由于具有新颖的结构和独特的生物活性，如今已经成为科学家研究的热点［1-2］。

软海绵属寻常海绵纲(Demospongiae)，软海绵目(Halichondrida)，软海绵科(Halichondridae)，在亚热带地区的海绵中较为常见。Halichondria属软海绵多与其共生体如细菌等生活在一起，通过过滤海水摄入大量微生物有机体，产生各种各样的特异性代谢产物，如大环内酯、萜类、鞘类脂糖苷、甾醇、生物碱、内酰胺等。其中很多化合物都具有新颖的结构和显著的抗菌、抗肿瘤等生物活性［3］。1986年Hirata and Uemura［4］等从Halichondria okadai中分离得到Halichondrin B，以其为先导化合物研制而成的药物Eribulin 作为治疗转移性乳腺癌的新型药物，已经于2010年9月15 日在美国上市。1996年，Kuramoto［5］等从Halichondria.okadai 中分离到halichlorine，该化合物能够抑制血管黏附分子VCAM-1的诱导表达。具有该作用的化合物对于动脉硬化、冠心病、非心血管感染性疾病等有治疗作用。1997年Kobayashi［6］等从日本冲绳岛软海绵Halichondriasp.中发现化合物halishigamides A～D 其对鼠淋巴瘤L1210 细胞和人表皮样瘤KB 细胞均有细胞毒作用。Chill［7］等从Halichondriasp.中分得1 个新的结构新颖的四环双哌啶halichondramine，但未报到其生物活性。2007年张红军［8］等从Halichondria rugosa中分离得到一个酯甾醇化合物，具有有较强的体外抗HIV-1 蛋白酶和抗HIV-1 整合酶活性。2012年，Naonobu Tanaka［9］等从Halichondriasp.分离出2个结构非常新颖的倍半萜二聚体，它们对KB 肿瘤细胞株均具有中等的细胞毒性。

我国南海海绵资源极为丰富，为了寻找结构新颖且有药用活性的先导化合物，我们对2009年3月采集于海南西沙群岛的Halichondriasp.进行了化学成分研究。从二氯甲烷与甲醇(1∶1)提取物中分离得到了了7 个结构很新颖的化合物，经现代波谱技术分析，并结合文献对照，确定其结构分别为:4α-Isocyanogorgon-11-Ene(1)，Homoverrucosanol (2)，neoverru--cosanol(2)，5α，6α-Epoxy-(22E)-ergosta-8，14，22-triene-3β，7α-diol (3)，5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol (4)，(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6α，9α-tetrol(6)，3β，5α，9α，14β-tetrahydroxy-(22E)-ergosta-7，22-dien-6-one(7)(结构见图1).对首次从该属中分离得到的化合物进行了体外活性评价，发现化合物1与化合物3 对HeLa 显示出较弱的细胞毒性，其IC50值分别为33.7 μM 和43.8 μM。本文主要报道以上7 个化合物的分离纯化以及结构鉴定工作。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

TLC:高效薄层层析板(HPTLC)为德国Merck公司产品和烟台江友硅胶开发有限公司产品。显色剂:10%硫酸香兰素溶液。EYELAN-1000 型旋转蒸发仪。HPLC:Waters 1525/2996，2998 HPLC;Agilent 1200;YMC-Pack(C8250 × 10 mm)。溶剂系统(石油醚:乙酸乙酯)，(石油醚:丙酮)，(正己烷:异丙醇)，(二氯甲烷:甲醇)等。常用有机试剂均为国产的分析纯。

软海绵Halichondriasp.于2009年3月采集于海南西沙永兴岛，样品由中科院海洋研究所李锦和教授鉴定，现保存于第二军医大学长征医院海洋药物实验室，编号为SHT。

图1 化合物1～7 的结构式Fig.1 Structures of compounds 1-7

1.2 提取与分离

将浸泡于95%乙醇溶液中的海绵样品(湿重3 kg)取出，剪碎，放入3 L 的玻璃瓶中，加入甲醇和二氯甲烷各1000 mL 超声提取7 次。将原95%乙醇浸泡液与超声提取液合并旋蒸至无醇味。用乙酸乙酯提取出有机相。分别用正己烷，二氯甲烷，正丁醇萃取。得到正己烷层75.3 g，二氯甲烷层18 g，正丁醇层50 g。二氯甲烷层首先用凝胶柱(甲醇与二氯甲烷各500 mL)洗脱，分为D1～D3，D2(10 g)用反向硅胶柱梯度洗脱以甲醇(M)∶水(W)(3∶7，2∶3，1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1)为流动相。得到14 个馏分(D2A～D2N).D2I 经硅胶柱分离，后采用高效液相色谱(YMC-Pack C8250 × 10 mm，2 mL/min)制备。以M∶W(3:1)为流动相得到化合物1(2.6 mg)。D2L 经硅胶柱分离以石油醚(P):乙酸乙酯(E)(20∶1，10∶1，5∶1，1∶1)乙酸乙酯为流动相，分离得到(D2L1～D2L8).D2L1 经硅胶柱洗脱(P∶E=30∶1)得到化合物2(221.3 mg)，化合物3(11.2 mg)。D2M 经硅胶柱洗脱(P∶E=20∶1，10∶1，5∶1，1∶1)，得到化合物4(10 mg)，化合物5(112.3 mg)，化合物6(6.3 mg)，化合物7(16 mg)。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

化合物1 无色油状物，ESI-MSm/z:263［M］+。分子式为C16H25NO2。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:4.10(1H，d，J=6 Hz，H-11)，3.97(1H，d，J=6 Hz，H-11)，2.24(1H，m，H-3)，1.87(1H，ddd，J=13.2，11.4，4.8 Hz，H-6)，1.73(1H，m，H-7)，1.67(1H，m，H-2)，1.60(1H，m，H-8)，1.53(1H，m，H-1)，1.47(1H，d，J=13.2 Hz，H-5)，1.47(1H，m，H-9)，1.45(1H，m，H-3)，1.42(1H，m，H-8)，1.26(3H，s，H3-14)，1.24(3H，s，H3-13)，1.15(1H，m，H-7)，1.06(1H，m，H-1)，1.00(1H，m，H-9)，0.98(3H，s，H3-15).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:158.8(C-16)，79.2(C-12)，68.2(C -11)，62.0(C-4)，59.7(C-5)，43.9(C-9)，40.8(C-1)，40.4(C-6)，39.9(C-3)，34.1(C-10)，26.5(C-7)，23.6(C-13)，20.9(C-4)，20.5(C-2)，19.3(C-15)，18.6(C-14)。其数据与文献［10］报道数据基本一致，故鉴定化合物1 为4α-Isocyanogorgon-11-Ene。

化合物2 白色固体，ESI-MSm/z:290 ［M］+。分子式为C20H34O。1H NMR(600Hz，CDCl3)δ:5.29(1H，d，J=5 Hz，H-2)，3.60(1H，ddt，J=2，3，11 Hz，H-5)，2.54(1H，ddd，J=2，11，13 Hz，H-4)，2.20(1H，dd，J=5，12 Hz，H-1)，2.05(1H，m，H-15)，2.03(1H，m，H-4)，1.89(1H，ddd，J=2，3，13 Hz，H-6)，1.76(3H，s，H3-18)，1.71(1H，ddt，J=3，7，11 Hz，H-13)，1.60(1H，m，H-12)，1.54(1H，dt，J=4，14 Hz，H-8)，1.47(1H，dd，J=11，13 Hz，H-6)，1.40(1H，m，H-9)，1.38(1H，m，H-12)，1.37(1H，m，H-11)，1.32(1H，dt，J=3，14 Hz，H-9)，1.23(1H，dt，J=3，14 Hz，H-8)，1.16(1H，t，J=11，H-14)，1.03(1H，q，J=11 Hz H-11)，0.86(3H，d，J=7 Hz，H3-17)，0.86(3H，s，H3-19)，0.83(3H，d，J=7 Hz，H-16)，0.78 (3H，s，H3-20)。13C NMR (150 MHz，CDCl3)δ:131.7(C-2)，131.3(C-3)，65.6(C-5)，58.9(C-6)，47.8(C-14)，46.8(C-13)，43.8(C-1)，42.6(C-4)，42.6(C-10)，39(C-8)，38.8(C-11)，38(C-7)，35.1(C-9)，28.0(C-15)，25.8(C-18)，22.9(C-17)，21.4(C-12)，20.0(C-19)，18.1(C-20)，14.9(C-16)。其数据与文献［11］报道数据基本一致，故鉴定化合物2 为homoverrucosanol。

化合物3 白色固体，ESI-MSm/z:290［M］+分子式为C20H34O。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:4.03(1H，dd，J=7，11 Hz，H-5)，2.15(1H，m，H-15)，1.90(1H，m，H-13)，1.69(1H，dd，J=7，13 Hz，H-6)，1.60(1H，m，H-12)，1.42(1H，m，H-9)，1.40(1H，m，H-12)，1.37(1H，m，H-11)，1.35(1H，m，H-9)，1.29(1H，dt，J=4，13 Hz，H-8)，1.19(1H，s，H-18)，1.16(1H，t，J=12 Hz，H-14)，1.10(1H，ddd，J=2，4，13 Hz，H-8)，1.05(1H，m，H-11)，1.02(1H，dd，J=4，12 Hz，H-1)，0.91(1H，d，J=7 Hz，H-17)，0.85(1H，ddd，J=4，5，8 Hz，H-2)，0.83(1H，s，H-19)，0.82(1H，d，J=7 Hz，H-16)，0.74((1H，s，H-20)，0.68(1H，dd，J=11，13 Hz，H-6)，0.56(1H，dd，J=5，8 Hz，H-3)，0.28(1H，t，J=5 Hz，H-3)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:71.2(C-5)，47.6(C-1)，47.2(C-6)，46.9(C-14)，45.2(C-13)，44(C-10)，39.2(C-11)，37.1(C-7)，35.3(C-8)，34.6(C-9)，28.7(C-15)，25.8(C-18)，25.6(C-2)，22.7(C-17)，22.0(C-4)，21.6(C-12)，19.6(C-3)，18.6(C-20)，17.2(C-19)，14.9(C-16)。其数据与文献［11］报道数据基本一致，故鉴定化合物3 为neoverrucosanol。

化合物4 无色针晶，ESI-MSm/z:426 ［M］+。分子式C28H42O3。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:6.5(1H，dd，J=1.8，3.3 Hz，H-15)，5.33(1H，dd，J=7.3，15.4 Hz，H-23)，5.28(1H，dd，J=8.1，15.4 Hz，H-22)，4.34(1H，dd，J=2.6，11.2 Hz，H-7)，3.02(1H，d，J=2.6 Hz，H-6)，3.82(1H，m，H-3)，2.45(1H，ddd，J=3.3，7.3，16.9 Hz，H-16)，2.18(1H，dd，J=11.4，16.9 Hz，H-16)，2.31(1H，m，H-20)，1.87(1H，dd，J=11.4，12.8 Hz，H-4)，1.63(1H，m，H-17)，1.13(3H，d，J=6.6 Hz，H3-21)，1.00(3H，d，J=6.6 Hz，H3-28)，0.92(3H，d，J=7.0 Hz，H3-27)，0.91(3H，d，J=7.0 Hz，H3-26)，0.84(3H，s，H3-18)，0.83(3H，s，H3-19)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:146.9(C-14)，139.1(C-9)，136.0 (C-22)，132.5 (C-23)，123.9 (C-15)，123.0(C-8)，68.3(C-3)，67.7(C-7)，65.2(C-5)，62.5(C-6)，56.6(C-17)，45.6(C-13)，43.3(C-24)，39.5(C-4)，39.3(C-20)，38.9(C-10)，37.6(C-16)，35.7(C-12)，33.4(C-25)，31.3(C-1)，30.8(C-2)，23.5(C-11)，23.1(C-19)，21.3(C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，18(C-28)，15.6(C-18).其数据与文献［12］报道数据基本一致，故鉴定化合物4 为5α，6α-Epoxy-(22E)-ergosta -8，14，22-triene-3β，7α-diol。

化合物5 无色针晶，ESI-MSm/z:428［M］+分子式C28H44O3。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:6.49(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，6.23(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，5.20(1H，dd，J=7.6，15.2 Hz，H-23)，5.12(1H，dd，J=7.6，15.2 Hz，H-22)，3.94(1H，m，H-3)，2.08～1.49(20H，m)，1.06(3H，s，H-19)，0.97(3H，d，J=6.4 Hz，H-21)，0.89(3H，d，J=5.2 Hz，H-28)，0.86(3H，s，H-18)，0.83(3H，d，J=4.8 Hz，H-26)，0.82(3H，d，J=4.8 Hz，H-27)。13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:135.5(C-6)，135.2(C-22)，132.4(C-23)，130.8(C-7)，82.1(C-5)，79.4(C-8)，66.5(C-3)，56.3(C-17)，51.7(C-14)，51.2(C-9)，44.6(C-13)，42.8(C-24)，39.7(C-20)，39.4(C-12)，37.0(C-4)，37.0(C-10)，34.6(C-1)，33.1(C-25)，30.2(C-2)，28.6(C-16)，23.4(C-11)，20.9(C-21)，20.6(C-15)，19.6(C-27)，19.1(C-26)，18.2(C-19)，17.6(C-28)，12.9(C-18)。其数据与文献［13，14］报道数据基本一致，故鉴定化合物5 为5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol。

化合物6 无定型粉末，ESI-MSm/z:446［M］+。分子式C28H46O4。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:5.22(1H，dd，J=7.7，15.4 Hz，H-23)，5.17(1H，dd，J=7.7，15.4 Hz，H-22)，5.06(1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-7)，4.03(1H，m，H-3)，3.96(1H，brs，H-6)，2.25(1H，ddd，J=4.0，13.6，13.6 Hz，H-1)，1.95(1H，d，J=12.1 Hz，H-2)，2.48(1H，m，H-14)，2.02(1H，m，H-20)，1.05(3H，s，H3-19)，1.02(1H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.92(3H，d，J=7.0 Hz，H3-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H3-27)，0.82(3H，d，J=7.0 Hz，H3-26)，0.58(3H，s，H3-18)。13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:142.6(C-8)，135.4(C-22)，132.7(C-23)，120.3(C-7)，77.1(C-5)，74.5(C-9)，70.3(C-6)，67.3(C-3)，55.8(C-17)，50.5(C-14)，43.8(C-13)，42.8(C-24)，41.0(C-10)，40.4(C-20)，40.2(C-4)，35.1(C-12)，33.1(C-25)，30.3(C-2)，28.1(C-16)，28.0(C-11)，26.5(C-1)，22.8(C-15)，21.1(C-21)，20.3(C-19)，20.0(C-27)，19.6(C-26)，17.6(C-28)，11.7(C-18)。其数据与文献［15］报道数据基本一致，故鉴定化合物6 为(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6α，9α-tetrol(6)。

化合物7 白色固体，ESI-MSm/z:460［M］+。分子式C28H44O5。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:6.50(1H，s，H-7)，5.45(1H，dd，J=8.8，15.4 Hz，H-22)，5.34(1H，dd，J=8.8，15.4 Hz，H-23)，4.06(1H，m，H-3)，2.80(1H，m，H-15)，2.38(1H，m，H-20)，2.33(1H，ddd，J=4.0，13.9，13.9 Hz，H-1)，1.00(3H，s，H3-18)，1.00(3H，d，J=6.6 Hz，H3-21)，0.99(3H，s，H3-19)，0.95(3H，d，J=6.6 Hz，H3-28)，0.85(3H，d，J=6.6 Hz，H3-27)，0.83(3H，d，J=6.6 Hz，H3-26)。13C NMR(CDCl3，150MHz)δ:199.4(C-6)，166.9(C-8)，135.3(C-22)，132.9(C-23)，122.8(C-7)，84.6(C-14)，79.3(C-5)，75.9(C-9)，66.7(C-3)，56.1(C-17)，49.8(C-13)，43.3(C-24)，43.3(C-10)，41.9(C-15)，39.5(C-20)，38.1(C-4)，37.4(C-12)，33.4(C-25)，31.7(C-2)，28.6(C-16)，28.0(C-11)，26.0(C-1)，22.9(C-19)，20.4(C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，17.9(C-28)，17.5(C-18)。其数据与文献［16］报道数据基本一致，故鉴定化合物7 为3β，5α，9α，14β-tetrahydroxy-(22E)-ergosta-7，22-dien-6-one。

2.2 讨论

化合物1，2，3 属于结构新颖的萜类化合物。化合物2，3 最初从植物中分离出来，这种verrucosane类的二萜在海绵中非常罕见。本文是第二次报道verrucosane 型二萜从海绵中分离出来，这为研究海洋生物与陆地生物生态学之间的关系提供了材料。化合物4，5，6 都为高度氧化的麦角甾醇衍生物，结构较为新颖。在细胞毒活性筛选中，对首次从Halichondriasp.中分离出来7 个化合物进行了活性评价，化合物1，3 对HeLa 显示出了较弱的细胞毒活性，IC50值分别为33.7 和43.8 μM。

1 Blunt JW，Copp BR，Hu WP，et al.Marine natural products.Nat Prod Rep，2009，26:170-244.

2 Hu J(胡静)，Yang B(杨斌)，Sun JF(孙见凡)，et al.Chemical Constituents of Marine SpongeHalichondriasp.from the South China sea.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2012，24:614-617.

3 Sun JB(孙晶波)，Lin HW(林厚文)，Li SL(李水林)，et al.Secondary metabolites and their bioactivities from marine spongeHalichondria.Chin Tradit Herb Drugs(中草药).2005，36:609-613.

4 Hirata Y，Uemura D.Halichondrins-antitumor polyether macrolides from a marine sponge.Pure Appl Chem，1986，58:701-710.

5 Kuramoto M，Tong C，Yamada K，et al.Halichlorine aninhibitor of VCAM-induction from the marine spongeHalichondria okadaiKadota.Tetrahedron Lett，1996，37:3867-3870.

6 Kobayashi J，Tsuda M，Fuse H，et al.Halishigamides A-D，new cytotoxic oxazole-containing metabolites from Okinaw an spongeHalinchondriasp..J Nat Prod，1997，60:150-154.

7 Chill L，Yosief T，Kashman Y，et al.Halichondramine，a new tetracyclic bipiperidine alkaloid from the marine spongeHalichondriasp..J Nat Prod，2002，65:1738-1741.

8 Zhang HJ(张红军)，Sun JB(孙晶波)，Lin HW(林厚文)，a new cytotoxic cholesterol sulfate from marine spongeHalichondria rugosa.Nat Prod Res，2007，21:953-958.

9 Naonobu T，Shohei S，Haruaki I，et al.Halichonadins K and L，New Dimeric Sesquiterpenoids from a SpongeHalichondriasp.Organic Letters.2012，14:3498-3501.

10 Xiong F，John RB，M BH，et al.Novel Oxidation Products of Two Sponge-Derived Sesquiterpenes，4α-For--mamedo-and 4α-Isocyanogorgon-11-Ene.Nat Prodt Letters，1997，12:5-83.

11 Junichi T，Irvina N，Tatsuo H，et al.Umabanol，a New Tetracyclic Diterpene from a Marine Spone.Chemistry Letters.1997.489-490.

12 Naoko O，Keiko A，Rie K，et al.Sterol Constituents from Two Edible Mushroom，Lentinula edodes and Tricholoma matsutake.Chem Pharm Bull，2000，48:749-751.

13 Tang JG(汤建国)，Shao HJ(邵红军)，Liu JK(刘吉开).Chemical constituents of Russula virescens.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2008，39:1776-1778.

14 Yang XL(杨小龙)，Zhu YC(朱应成)，Fang ST(方圣涛)，et al.Chemical Constitutes of Termitomyces schimperi Collected from Africa.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2010，22:972-975.

15 Yasunoria Y，Keiko A，Hiroyuki O，et al.Sterol constituents from five edible mushrooms.Chem Pharm Bull，1998，46:944-950.

16 Yasunori Y，Kaori M，Takeyoshi I，et al.New sterols and triterpenoids from four edible mushrooms.Chem Pharm Bull，2001，49:589-594.