均匀设计法优选桑叶总黄酮提取工艺的研究

李秀英，黄文华，陈 文

（江西中医药高等专科学校，江西 抚州 344000）

桑叶为桑科植物桑的叶，于霜降后9月至10月间采收，除去杂质后晒干可药用。《神农本草经》记载：本品味苦、甘，性寒，归肺、肝经；功能为疏散风热、清肺润燥、清肝明目；主治风热感冒、头昏头痛、目赤昏花等[1]。现代药理研究证实，桑叶中的黄酮类成分具有抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成的作用[2]。因此，研究和探讨桑叶中黄酮类成分的提取工艺对利用桑叶具有重要意义。笔者通过均匀设计，优选出合理的桑叶总黄酮提取工艺，旨在为生产工艺参数的选择提供理论数据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

SYC智能型超级恒温水浴锅 （上海普渡生化科技有限公司），FA-B型万分之一天平（上海精密仪器仪表有限公司），EU-2800DA双波长紫外可见分光光度计（上海昂拉仪器有限公司），RE-2000B旋转蒸发仪（上海科升仪器有限公司）。

1.2 试剂

所用试剂甲醇、无水乙醇、冰醋酸、亚硝酸钠等均为分析纯，芦丁标准品（购自中国药品生物制品检定所，批号：100080-200809）。

1.3 材料

桑叶药材于2014年4月购自樟树药材市场，经笔者鉴定为桑科植物桑的干燥叶片，粉碎过40目筛备用。

2 方法与结果

2.1 桑叶总黄酮含量测定[3]

2.1.1 供试品溶液制备 精确称取过40目筛的桑叶药材3份，每份5.0g，加50mL乙醇，采用热回流法提取。每份平行提取两次，过滤，合并滤液，定容至100mL即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精确称取在110℃干燥至恒重的芦丁对照品10.3mg，置于50mL容量瓶中，加50%甲醇适量，超声使其溶解，定容至50mL，摇匀。精密量取20mL置于50mL容量瓶中，加水定容至50mL即得。

2.1.3 测定波长确定 精密量取对照品溶液3mL和供试品溶液2mL，分别置于25mL刻度的试管中，各加水至5mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置8分钟；加10%硝酸铝溶液1mL，放置8分钟；加氢氧化钠试液15mL，加水至刻度，摇匀，放置15分钟；用相应的试剂作为空白对照，在300～600nm波长范围内进行扫描。对照品和供试品溶液在415nm处有最大吸收，且光谱形状极为相似，形成的络合物在常温下稳定性好，满足分光光度法测定的基本要求。因此，选定415nm作为测定波长。

2.1.4 标准曲线绘制 精密量取对照品溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL，分别置于25mL刻度试管中，加水至6.0mL（6.0ml的对照品溶液中不加水），加5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀，放置8分钟；加10%硝酸铝溶液1.0mL，放置6分钟；加氢氧化钠试液15mL，加水至25mL，摇匀，放置15分钟；用相应的试剂作为空白对照，在415nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，并得到回归方程为：Y=11.31X+0.023，R=0.999。对照品芦丁的浓度在0.0026～0.0128mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.5 桑叶总黄酮的测定 精密量取桑叶提取液2.0mL，置于5mL容量瓶中，用相应的试剂作为空白对照，按照2.1.4描述的方法加入试剂，测定吸光度，并计算总黄酮含量。

2.2 方法学研究

2.2.1 精密度试验 精密量取同一供试品溶液1.0mL，按2.1.4项操作，平行测定5次，RSD（相对标准偏差）为0.89%，表明该方法精密度良好。

2.2.2 重复性试验 取同一供试品溶液5份，每份精密量取1.0mL，按2.1.4项操作，测定，RSD为0.51%，表明该方法重现性良好。

2.2.3 稳定性试验 在室温下，精密量取同一供试品溶液1.0mL，在0小时、1.0小时、2.0小时、3.0小时、4.0小时分别测定吸光度，分别为0.357、0.359、0.356、0.358、0.358，计算其RSD为0.20%，说明供试品溶液在4小时内稳定。

2.2.4 回收率试验 精密量取已知总黄酮含量的同一供试品溶液0.5mL，取5份，分别精密加入对照品溶液适量，按2.1.3项操作测定吸光度，得出总黄酮含量，计算出加样回收率。结果显示，平均回收率为97.4%，RSD为1.0%，表明该法回收率良好。

2.3 均匀试验设计及结果

2.3.1 因素水平及指标的确定 采用乙醇回流法提取桑叶总黄酮，主要影响因素为乙醇浓度（%）、料液比（g：ml）、提取温度（℃）、提取时间（小时）4个因素。因此，以上述4个因素设置7个参考水平，以总黄酮含量为评价指标，用U9（64）均匀设计表安排试验[4]，优选最佳提取条件。各因素水平见表1。

表1 因素水平

2.3.2 均匀设计结果及分析 按2.1.1项方法制备供试品溶液，按1～6号参数分别精密量取0.5mL，按2.1.4项操作测定各因素水平下的吸光度。采用SAS软件的非线性回归法进行拟合[5]，根据拟合结果的决定系数（R2）和模型显著性检验P值，调整模型拟合的参数，最后确定拟合的模型为Y=0.921+0.014 3A+0.0632B+0.0890C+0.0241D，复相关系数R2=0.9971，F=10.53，P<0.05。从决定系数和模型检验结果看，模型是可信的。通过方差分析各项对回归的贡献：A>B>D>C，且最佳提取工艺为A6B4C6D4，即乙醇浓度为75%、料液比为1:20（g：mL）、提取温度为80℃、提取时间为2小时。

2.3.3 验证试验结果 根据优化工艺，制备3批样品，测定其中总黄酮的含量，得平均值Y=1.57%，与理论推测值相近，在其范围区间内，具体结果见表2。

表2 验证试验结果

3 讨论

通过对均匀设计试验结果的分析，确定提取溶媒（乙醇）的浓度为影响桑叶总黄酮提取率的主要因素，且影响显著，料液比次之，而提取时间和提取温度对桑叶总黄酮提取率的影响较前两者影响相对小。综合优选，最后确定最佳提取工艺为料液比1：20（g：mL），乙醇浓度75%，提取时间2小时，提取温度为80℃。通过该方法优选出的提取工艺简单、稳定、可行，可用于工厂化推广。

[1]高中松，丁文，高亮.超声波提取桑叶中总黄酮的工艺研究[J].中国农学通报，2006，22（4）：116-117.

[2]原爱红，黄哲，马骏，等.桑叶黄酮的提取及其降糖作用的研究[J].中草药，2004，35（11）：52-56.

[3]祝波，王亚红.正交优化超声波法提取瓦松总黄酮工艺的研究[J].中成药，2012，34（12）：2426-2427.

[4]高毅，高尚.均匀设计优化方法[J].科学技术与工程，2011，11（2）：1671-1672.

[5]周仁郁.SPSS13.0 统计软件[M].成都：西南交通大学出版社，2005.