局部应用水蛭素对大鼠血管吻合模型术后血栓形成的观测

胡 哲，张 静，郭鹏年

（1.包头医学院职业技术学院，内蒙古 包头 014030；2.包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010）

血管显微外科成功的关键在于显微血管吻合口通畅，吻合口局部血栓形成是导致通畅率低的主要原因之一[1-2]。目前临床上常用的防治微血管吻合术后血栓形成的药物有西药中的肝素、低分子右旋糖酐、阿司匹林、潘生丁等，中药中的丹参[3]、川芎[4]、水蛭[5]等。

潘浩等[6]认为水蛭具有减少兔的股动静脉吻合口血栓形成，提高远期通畅率的作用。但水蛭疗法可能出现贫血、感染、败血症等严重并发症，静脉应用水蛭素可能出现出血、过敏、致死等问题，且水蛭素的用量、用法、凝血指标检测等依然不确定。基于以上问题，本研究制作了血管吻合模型，分别局部应用生理盐水（0.9%氯化钠注射液）、肝素溶液（62.5U/ml）、水蛭素溶液（1ATU/ml），并通过观察不同时间点吻合血管的通畅率、吻合口组织形态学变化，评估血栓面积等方法来探讨局部应用水蛭素对微血管吻合术后血栓形成的影响，为水蛭素应用于显微外科血管吻合术提供实验依据，从而为临床提高显微血管吻合口通畅率提供药物支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠120只，均为雌性，体重200～240g，平均（210±11）g，从内蒙古医科大学动物实验中心购入。在包头医学院第一附属医院动物实验室饲养（室温约22℃～24℃，每天喂食2～3次，自由饮水）。

1.2 动物模型制作

将Wistar大鼠统一编号，按完全随机分组方法分为生理盐水组、肝素组、水蛭素组，每组40只。全部用10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉，备皮后碘伏消毒手术野皮肤，在股内侧做一纵行切口（起自腹股沟韧带中点，至股骨中下段），逐层分离组织，并游离出股动脉，暴露长度2cm，用两个微血管夹（远近端相距1cm）阻断股动脉，然后于中点处横行切断，修剪外膜。接着，生理盐水组用0.9%氯化钠注射液（山东华鲁制药有限公司，批号：D11081304，规格：500ml/瓶）、肝素组用62.5 U/ml肝素溶液（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号：1006108，规格2ml:12500单位/安瓿）、水蛭素组用1ATU/ml水蛭素溶液（广西科康生物科技有限责任公司，批号：20110312，规格：30ATU/瓶）冲洗血管腔。再全部用11-0尼龙线做原位断端缝合，吻合进针时保证针尖与血管壁以垂直角度进入，边距、针距均匀一致，内膜对合良好，一般前、后壁各3针，共6针，每针缝线打3道结。每个吻合口在吻合最后一针未打结之前，用注射器针头向吻合口内注入相应溶液（生理盐水组：0.9%氯化钠注射液，肝素组：62.5U/ml肝素溶液，水蛭素组：1ATU/ml水蛭素溶液）至吻合口充盈为止，然后完成打结。吻合完成后，再向吻合断端局部注射3ml相应溶液（同上），观察血管通血情况，血管通畅实验确认吻合成功。用1号慕丝线关闭伤口，同法处理另一侧股动脉。手术完毕后，将大鼠置于单笼饲养，自由活动。保持饲养室温度为23℃。

1.3 观察血管通畅情况

分别于术后2小时、24小时、3天、5天4个时间点从每个实验组取10只大鼠，打开切口，显露吻合后的血管（每组每个时间点两侧股动脉共20条血管），观察血管吻合后的通畅情况。

1.4 组织学观察及图像分析

于术后4个时间点行大体观察后将吻合血管段取出（长约1cm），经4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续5μm切片，HE染色，脱水，封片。在光学显微镜下观察组织形态，取相当于血管血栓体部中点的切片，用ImageProPlus6.0医学图像处理系统测量血栓比值。

1.5 统计学处理

结果以（±s）表示，3组间通畅率比较用行×列表χ2检验，3组间血栓比值比较用F检验和q检验。

2 结果

2.1 大体观察及血管通畅率

术后2小时，血管与周围组织无粘连，吻合口有轻度水肿，无血块黏附于血管壁，血管腔无狭窄，吻合血管通畅率均为100%，3组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 术后2 小时3 组间血管通畅情况比较

术后24小时，血管与周围组织发生轻度粘连，大部分吻合口通畅，吻合口处外壁稍隆起，血管无狭窄。部分血管吻合口附近壁内可见血凝块，远端血流量小，流速慢，血管通畅实验呈弱阳性，远端血管变细。生理盐水组、肝素组、水蛭素组血管通畅率进行两两比较，无显著性差异（P>0.05），见表2。

表2 术后24 小时3 组间血管通畅情况比较

术后3天，血管内无血块，栓塞血管可见血凝块附着壁内，远端血管内无血液流动，血管通畅实验呈阳性，血管苍白。生理盐水组、肝素组、水蛭素组血管通畅率进行两两比较，无显著性差异（P>0.05），见表3。

表3 术后3 天3 组间血管通畅情况比较

术后5天，血管粘连加重，不易游离。缝线部分可见，栓塞血管可见血凝块附着壁内，血管通畅实验呈阳性，管腔变细。生理盐水组、肝素组、水蛭素组血管通畅率进行两两比较，无显著性差异（P>0.05），见表4。

表4 术后5 天3 组间血管通畅情况比较

2.2 组织学观察及图像分析

可见内皮细胞损伤性改变，内皮细胞肿胀、部分脱落，中膜层平滑肌细胞变性坏死，外膜纤维组织增生及炎性细胞浸润，中性白细胞浸润随时间延长呈减弱趋势。

各组血栓吻合口内可见血栓形成，内皮细胞部分脱落，中层纤维组织增生，各组间在组织上的病变差别不大（P＞0.05）。

术后2小时，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（3.32±1.16）%、（1.13±0.75）%、（1.22±0.87）%，肝素组和水蛭素组血栓比值低于生理盐水组（P<0.05），肝素组和水蛭素组之间比较，无显著性差异（P>0.05）。

术后24小时，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（8.21±1.55）%、（5.23±1.28）%、（3.51±1.08）%，经统计学分析，肝素组、水蛭素组、生理盐水组血栓比值3组间两两比较，有显著性差异（P<0.01）。

术后3天，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（11.27±3.21）%、（7.13±2.14）%、（4.56±1.88）%，经统计学分析，生理盐水组、肝素组和水蛭素组血栓比值3组间两两比较，有显著性差异（P<0.01）。

术后5天，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（13.47±2.91）%、（9.34±2.04）%、（6.35±1.78）%，经统计学分析，生理盐水组、肝素组和水蛭素组血栓比值3组间两两比较，有显著性差异（P<0.01），见表5。

表5 术后不同时间3 组间血栓比值（±s，%）

表5 术后不同时间3 组间血栓比值（±s，%）

注：与生理盐水组比较，▲P＜0．05；与生理盐水组比较，★P＜0．01；与肝素组比较，■P＜0．01

2小时血栓比值24小时血栓比值3天血栓比值5天血栓比值生理盐水组 肝素组 水蛭素组3.32±1.16 8.21±1.55 11.27±3.21 13.47±2.91 1.22±0.87▲3.51±1.08★■4.56±1.88★■6.35±1.78★■1.13±0.75▲5.23±1.28★7.13±2.14★9.34±2.04★

3 讨论

3.1 运用水蛭素的临床意义

人类应用水蛭治疗疾病可以追溯到距今3500多年前[7-10]。水蛭入药在我国最早记载于东汉时期的药物学专著《神农本草经》，至今也有2000多年的历史。我国中医认为水蛭具有破血逐淤通经的功效，主要用于治疗血瘀经闭、症瘕痞块、跌打损伤。薛凤等[11]将单味中药水蛭制成粉状，口服治疗高黏血症患者30例，其血脂、血黏度、血小板的降低及临床症状的改善均优于阿司匹林组（P＜0.05）。

3.2 血管吻合后通畅率的比较

3组血管吻合后通畅率均随着时间延长逐渐下降。术后2小时，3组通畅率均为100%；术后24小时，生理盐水组为85%，肝素组为90%，水蛭素组为95%；术后3天，生理盐水组为80%，肝素组为90%，水蛭素组为90%；术后5天，生理盐水组为80%，肝素组为85%，水蛭素组为90%。这与血栓形成的规律较为符合。术后24小时、3天、5天，肝素组和水蛭素组通畅率均高于生理盐水组，但进行统计学分析后，显示3组间血管的通畅率比较，无显著性差异（P＞0.05）。这可能是由于每组每个时间点的实验样本量较小（20条血管）的原因造成。

3.3 血栓比值

行组织形态学检查，3组血管血栓比值随时间延长而逐渐增大。术后2小时，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（3.32±1.16）%、（1.13±0.75）%、（1.22±0.87）%；术后24小时，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（8.21±1.55）%、（5.23±1.28）%、（3.51±1.08）%；术后3天，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（11.27±3.21）%、（7.13±2.14）%、（4.56±1.88）%；术后5天，生理盐水组、肝素组、水蛭素组血栓比值分别为（13.47±2.91）%、（9.34±2.04）%、（6.35±1.78）%。这一规律与陈铁军等[12]的研究结果一致。

综上所述，在术后2小时、24小时、3天和5天时，肝素组与水蛭素组的血管通畅率比较，无显著性差异（P＞0.05），但后3个时间点3组间血栓比值两两比较，有显著性差异（P＜0.01）。说明当有少量血栓形成时，可能对血管的通畅率无明显影响。本研究仅观察了血管吻合后早期的血管通畅情况，但其远期效果如何以及能否保持相对的稳定，还有待深入研究。

[1]Wieslaander J B，Aberg M，Dougan P． Accumulation of isotype Labelled platelets in small arteries after end to end and end in end anastomoses in the rabbit[J]． Br J Plast Surg，1982，35（4）：158-159．

[2]Chien W，Varvares M A，Hadlock T，et al． Effects of aspirin and lowdose heparin in head and neck reconstruction using microvascular free flaps[J]．Laryngoscope，2005，115（6）：973-976．

[3]周武雄，钟慈声，袁伟，等．血管吻合术后过氧化氢的形成及丹参素对超氧自由基的作用[J]．上海医科大学学报，1998，25（2）：115-117．

[4]郭君红．川芎嗪防治家兔微血管吻合术后血栓形成的实验研究[D]．武汉：湖北中医学院，2003．

[5]马进理，潘浩．水蛭防治微血管吻合术后血栓形成的实验研究[J]．浙江中西医结合杂志，1999，9（1）：25-26．

[6]潘浩，胡秀慧．水蛭防治微血管吻合口血栓形成的实验研究[J]．中国中医骨伤科，1999，7（3）：1-3．

[7]Whitaker I S，Rao J，Izadi D，et al． Historical article : hirudo medicinalis : ancient origins of ，and trends in the use of medicinal leeches throughout history[J]．Br J Oral Maxillofac Surg，2004，42（2）：133-137．

[8]Hyson J M．Leech therapy:a history[J]．J Hist Dent，2005，53（1）：25-27．

[9]Abdelgabar A M，Bhowmick B K．The return of the leech [J]．Int J Clin Pract，2003，57（2）：103-105．

[10]Aslan G，Terzioqlu A，Tuncali D． The reusable medicinal leech[J]．Plast Reconstr Surg，2003，111（3）：1358-1359．

[11]薛凤，赵圣美．单味中药水蛭治疗高黏血症30 例[J]．山东医药，1997，37（4）：51-52．

[12]陈铁军，陈瑞芬，常松，等．家兔股动脉血栓形成模型及其形态学观察[J]．首都医学院学报，1991，12（1）：23-26．