脉冲电磁场联合电针疗法对去卵巢大鼠骨质疏松的影响

周 君，何红晨,肖 登,陈世菊,刘慧芳,覃渝茜,何成奇

(1.南华大学附属第一医院康复科，湖南 衡阳421001；2.四川大学华西医院康复科 康复医学四川省重点实验室)

骨质疏松症是一种伴随增龄衰老或医学原因引起的以骨量降低、骨微细结构受损导致骨脆性增加和易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病[1]。随着中国人口老龄化，骨质疏松症及其骨质疏松性骨折这一问题也更加突出，严重影响中老年人的生活质量，并且医疗支出巨大，给个人、家庭、社会带来沉重的经济负担。临床研究表明脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields，PEMFs)[2-3]和针灸[4]均能增加骨密度、缓解患者疼痛症状及提高患者生活质量，显示出很广的临床应用前景。本课题组前期实验研究显示脉冲电磁场[5-6]和电针疗法[7]均能改善骨代谢生化指标、增加骨密度及改善骨生物力学性能。骨质疏松症作为一种多因性、复杂的慢性疾病，应进行综合康复治疗。进行多种治疗方法联合应用以求发挥最大协同疗效的研究是有意义的，必将更好地为患者服务。本研究观察脉冲电磁场联合电针疗法对去卵巢大鼠骨密度、骨组织形态和骨生物力学性能指标的影响，探索联合治疗是否具有协同作用，为脉冲电磁场联合电针疗法应用于骨质疏松症的治疗作理论和实践的探索。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

XT-2000B型骨质疏松治疗治疗仪(中国，天津)；华佗牌SDZ-V型电针治疗仪(中国，江苏)；双能X线骨密度测量仪(DEXA，美国)；Laica切片机(德国)；奥林巴斯光学显微镜(日本)；AGS-J电子万能试验机(日本)。3月龄未育雌性Sprague-Dawley大鼠50只，由四川大学华西医院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 实验动物饲养于四川大学华西医院动物实验中心，清洁级环境。适应性饲养1周后，按随机数字表法把50只实验大鼠随机分为假手术组、去势组、脉冲电磁场组、电针组和联合组，每组10只。参照文献[8]，除假手术组外，其余各组大鼠均施行双侧卵巢切除术，术后每只大鼠肌肉注射青霉素4万U，每天1次，连用3天以预防感染。假手术组大鼠只切除卵巢周围与卵巢大小相仿的脂肪组织。每只实验大鼠分笼饲养在温度20～26℃、湿度60％～70％、12 h间隔照明的环境中，自由摄食和水。

1.2.2 干预方法 去卵巢术后1周，各治疗组给予相应干预治疗。脉冲电磁场组：采用XT-2000B型骨质疏松治疗治疗仪,具体干预参数为：强度3.82 mT，频率8 Hz，时间每次40 min，每天1次，每周5天，共12周。电针组：穴位双侧“足三里”、 “三阴交”，采用直径0.25 mm、长度25 mm一次性无菌针灸针刺入，进针后针柄连接电针，波形为疏密波，疏波频率3 Hz，密波频率15 Hz，波宽1 ms，强度以局部肌肉轻微收缩为度 (0.7～1.0 mA)，每次30 min，每天1次，每周5天，共12周。联合组：采用脉冲电磁场联合电针疗法，具体操作同以上两组。假手术组和去势组不予任何干预。

1.2.3 标本采集及组织形态学观察 干预12周后，处死大鼠后，迅速取出左侧股骨，剥离肌肉,用于骨密度和生物力学性能检测；取出左侧胫骨，生理盐水冲洗,40 g/L中性缓冲甲醛固定,100 g/L乙二胺四乙酸二钠脱钙,每2天更换脱钙液1次,共脱钙4周,系列乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚度5 μm，常规HE染色，光镜下观察骨组织形态结构。

1.2.4 骨密度测定 用双能X线骨密度测量仪测定实验动物左股骨骨密度,将股骨放在盛有深约2.5 cm的蒸馏水(用于模拟骨周围的软组织)的容器中，用小动物软件进行扫描。测量完毕后，股骨标本用生理盐水湿纱布包裹后保存于-20℃环境中，以备生物力学测定。

1.2.5 骨生物力学性能测定 测量时取出标本复温后，在电子万能材料试验机上做股骨三点弯曲试验和L5椎体压缩试验，直到骨折。三点弯曲试验时支点跨距为20 mm，两个试验的加载速度均为2 mm/min，用函数记录仪描记载荷-位移曲线，记录最大载荷和破坏能2个指标。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 骨密度检测

左股骨骨密度与假手术组比较，去势组骨密度明显下降(P<0.01)；脉冲电磁场组、电针组和联合组的骨密度比去势组显著增高(P<0.01，P<0.05)；而脉冲电磁场组、电针组和联合组3组之间股骨骨密度无统计学差异(P>0.05)。L5椎体骨密度与假手术组比较，去势组骨密度明显下降(P<0.01)；脉冲电磁场组、电针组和联合组的骨密度比去势组显著增高(P<0.01)；与脉冲电磁场组和电针组比较，联合组L5椎体骨密度明显增高(P<0.05)(图1)。

图1 股骨及L5椎体骨密度检测

2.2 骨组织形态学观察

如图2所示，与假手术组比较，去势组骨小梁面积、骨小梁数量和骨小梁链接数明显减少，骨髓腔显著增大；然而，经过12周干预治疗后，脉冲电磁场组、电针组和联合组与去势组比较，骨小梁面积、骨小梁数量和骨小梁链接数明显增加，而骨髓腔显著减少。

图2 干预12周后各组胫骨HE染色结果(×100)

2.3 骨生物力学检测

股骨三点弯曲试验发现(图3)，与假手术组比较，去势组最大载荷明显下降(P<0.01)；脉冲电磁场组和联合组的最大载荷比去势组显著增高(P<0.05)；而脉冲电磁场组、电针组和联合组3组之间最大载荷无统计学差异(P>0.05)。与假手术组比较，去势组破坏能明显下降(P<0.05)；脉冲电磁场组、电针组和联合组的破坏能与去势组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。

L5椎体压缩试验发现(图4)，与假手术组比较，去势组最大载荷明显下降(P<0.01)；脉冲电磁场组、电针和联合组的最大载荷比去势组显著增高(P<0.01)；与脉冲电磁场组和电针组比较，联合组最大载荷明显增高(P<0.05，P<0.01)。与假手术组比较，去势组破坏能明显下降(P<0.01)；与去势组比较，脉冲电磁场组、电针组和联合组的破坏能显著增高(P<0.01)；与脉冲电磁场组和电针组比较，联合组破坏能明显增高(P<0.01)。

3 讨 论

图3 股骨三点弯曲试验

图4 L5椎体压缩试验

随着全球人口老龄化，骨质疏松症及骨质疏松性骨折的发病率逐渐上升。目前，尚无确切的全国性骨质疏松症患病率资料，国内部分地区(北京、石家庄、上海、长春、广州和成都)原发性骨质疏松症总患病率(按骨密度累计丢失率最高部位计算)为12.4％[9],50岁以上人群总骨折患病率为26.6％,髋部骨折患病率为1.9％，脊椎骨折患病率为13.3％[10]。2005年美国超过200万人发生骨质疏松性骨折，直接经济花费为170亿美元[11]。骨质疏松症及其骨质疏松性骨折严重影响中老年人的生活质量，并且相关医疗花费巨大，给个人、家庭及社会带来沉重的经济负担。因此，探索骨质疏松症的有效而安全的治疗方法，具有肯定的社会效益和经济效益。

骨质疏松症作为一种常见多发的慢性疾病，临床上常进行综合康复治疗，探讨多种治疗方法联合应用以求发挥最大协同疗效并研究其作用机制具有重要意义。目前国内外仅见1项有关脉冲电磁场联合电针治疗骨质疏松症的临床研究报告[12]，而未见有关基础实验研究。因此，本研究拟通过观察脉冲电磁场、电针及脉冲电磁场联合电针疗法对去卵巢大鼠骨密度、骨组织形态、骨生物力学性能的影响，探索脉冲电磁场与电针是否具有协同作用。作为治疗骨质疏松症的新技术，脉冲电磁场的有效性正受到业界高度关注，脉冲电磁场对骨质疏松引起的疼痛、骨量丢失、骨密度降低具有肯定的治疗作用[2-3]。前期实验研究[5-6]也显示脉冲电磁场能提高去势大鼠血清雌二醇水平、增加去势大鼠骨密度，改善骨生物力学性能。临床研究显示针灸也能增加骨质疏松症患者骨密度、缓解患者疼痛症状及提高患者生活质量[4]。尽管中医学中无骨质疏松症这一病名，但根据其临床表现，可归属于中医学“骨痿”范畴，其病理基础是肾虚和脾虚，病变的临床表现多为瘀血阻络之像，针灸治疗以补益脾肾、强筋健骨为治疗原则。前期研究表明针刺足三里、三阴交能改善去势大鼠骨代谢生化指标、提高骨密度、改善骨生物力学性能，激活成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路，促进骨形成[7]。足三里为足阳明胃经的合穴，三阴交为足三阴经的交会穴，针刺这两个穴位能补肾健脾，益髓补骨，强筋健骨。所以，在本研究中选用电针足三里及三阴交这两个穴位。

骨密度是衡量骨量多少的定量指标，可以测量出不同部位如髋部或脊柱的骨矿物质的含量，骨密度已经成为诊断骨质疏松症的金标准[1]。基于去势大鼠皮质骨和小梁骨骨量丢失程度和速度的差异性[13]，本研究分别检测小梁骨丰富的L5椎体和皮质骨为主的股骨的骨密度。本研究中去势导致大鼠股骨骨密度下降，而脉冲电磁场、电针及联合疗法均能增加其骨密度，但是联合疗法并不比脉冲电磁场、电针单独使用疗效更好。对于小梁骨丰富的L5椎体，在去势手术后，骨密度显著降低，而脉冲电磁场、电针和联合疗法均能增加其骨密度，而且，联合疗法增加骨密度的疗效还优于脉冲电磁场或电针单独使用的疗效。本研究结果显示脉冲电磁场、电针及联合疗法均能增加去势大鼠L5椎体及股骨骨密度，而且，对于腰椎骨密度的提高，脉冲电磁场联合电针疗法具有协同作用，而对股骨骨密度的提高，联合治疗并不优于脉冲电磁场或电针单独使用。联合疗法对L5椎体和股骨骨密度提高程度不同，这可能与股骨主要由皮质骨组成，L5椎体由小梁骨组成的结构差异性造成的。

骨的生物力学性能由骨量和骨的质量两方面决定[14]。骨量可以用定量指标骨密度去衡量，而骨质量包括一系列的骨组织特性：骨的形态、微细结构、微损伤程度等。所以，本研究观察了脉冲电磁场、电针及联合治疗对去势大鼠骨组织形态学的影响，结果显示经过12周干预治疗后，脉冲电磁场、电针和联合疗法均能增加骨小梁面积、骨小梁数量和骨小梁链接数明显增加，减少骨髓腔的大小。

骨生物力学性能是反映骨易碎性的指标，可以预测骨折发生的风险，改善骨的生物力学性能，是目前判断一种治疗方法治疗骨质疏松症是否有效的一个关键指标[15]。在骨质疏松症患者，最关心的就是骨的生物强度，对于正常骨不引起骨折的负荷而在骨质疏松症中而可以导致骨折。所以很多研究探索了骨量丢失在骨的生物力学性能下降中的重要程度，对绝经后妇女或动物模型的骨组织进行了各种各样的生物力学检测，包括压缩、弯曲、剪切等。骨质疏松症患者椎体的最大应力和最大弹性模量下降[16]，去势动物模型的椎体压缩和股骨三点弯曲试验都提示骨生物力学性能下降[17]。本研究观察了脉冲电磁场、电针及联合疗法对股骨三点弯曲试验和椎体压缩试验的影响，结果显示去势大鼠股骨和L5椎体的最大载荷和破坏能显著下降。脉冲电磁场、联合疗法可以增加股骨的最大载荷，而脉冲电磁场、电针及联合疗法对股骨破坏能没有明显影响。脉冲电磁场、电针及联合疗法均能增加腰椎的最大载荷和破坏能，并且联合疗法优于脉冲电磁场或电针单独治疗。

本研究结果显示脉冲电磁场联合电针疗法对去势大鼠股骨骨密度及生物力学性能改善并不优于脉冲电磁场或电针疗法单独使用，而联合疗法对椎体骨密度及生物力学性能改善明显优于脉冲电磁场或电针疗法单独使用，提示尽管这两种治疗方法协同作用机制尚不明确，在临床联合应用脉冲电磁场和电针疗法对骨质疏松症患者腰椎骨密度和生物力学性能的改善可能比这两种治疗方法单独使用更为有效。对于协同作用的机制及两种治疗方法的安全性尚需进一步的研究。

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