Kiss-1与结肠癌SW480细胞增殖的关系

钟 华，吴雪艳，刘迪群

(南华大学附属第一医院消化内科，湖南 衡阳 421001)

结肠癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率位居第二位,仅次于胃癌,且近年呈现年轻化及上升趋势。细胞恶性增殖是恶性肿瘤的重要生物学特性之一，它与肿瘤的恶性程度直接相关。Kiss-1是继nm23之后，Lee等[1]应用微细胞介导的染色体杂交技术及差减杂交技术在人黑色素瘤细胞株中发现的一种肿瘤转移抑制基因。其定位于染色体1q32-q41，基因序列中包含四个外显子，其编码的蛋白kisspeptin是由145个氨基酸组成的亲水性多肽[2]。本研究旨在体外构建高表达Kiss-1的人结直肠腺癌细胞株(SW480)细胞株模型，拟探讨Kiss-1基因对结肠癌增殖的影响，为结肠癌患者创造新的治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与细胞培养

人结肠癌细胞株SW480(湘雅医学院肿瘤研究所惠赠)培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，置于37 ℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。质粒pEGFP-N1-Kiss-1及空载质粒由上海吉凯公司合成，两种质粒均含有GFP绿色荧光,经上海吉凯公司测序鉴定无误。质粒小提试剂盒为康为公司产品，脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000购自美国invitrogen公司，G418及CCK8试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，兔抗人Kiss-1一抗购自武汉博士德生物工程有限公司，二抗购自美国Epitomics公司。

1.2 质粒扩增与提取

LB肉汤(Luria-Bertani,LB)2.5 g加入100 mL一级水中配置成25 mg/mL的LB液态培养基，高温蒸汽消毒备用。培养基中加入卡那霉素，使其终浓度为30 μg/mL。质粒pEGFP-N1-Kiss-1及空载质粒各100 μL分别加入5 mL LB培养基中，37 ℃、180 r/min震荡16 h。提取纯化质粒并进行琼脂糖凝胶电泳及分光光度计测量质粒浓度。

1.3 稳定转染

细胞生长至90％～95％融合度时进行转染。用无血清1640培养基将8 μg pEGFP-N1-Kiss-1质粒和10 μL Lipofectamine2000分别稀释至总体积为250 μL，室温下静置5 min。轻轻混匀两种溶液，室温下静置20 min，将混合液加入SW480细胞中，37 ℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养6 h。吸去培养基，PBS液洗两遍，加入含10％胎牛血清的1640培养基终止转染。42 h后更换完全培养基,加入500 μg/mL G418筛选，培养3～4天待细胞大量死亡时，降低G418浓度至300 μg/mL维持筛选4周左右,获得稳定转染细胞。空载体pEGFP-N1转染SW480细胞作为阴性对照组。

1.4 Western blot鉴定Kiss-1在SW480细胞中的表达

分别提取空白对照组、阴性对照组及实验组中SW480细胞总蛋白，用15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转法转移至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride，PVDF膜)，丽春红染色验证后用含5％血清的TBST封闭2 h，依次孵育对应一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗，最后暗室曝光显像,检测其中Kiss-1表达的变化。

1.5 CCK8法检测细胞增殖情况

已处对数生长期的各组细胞用0.25％胰酶消化，制成细胞悬液接种于96孔板内(每孔2×103个细胞)定容至100 μL培养，每组细胞设3个复孔，同时设置3个空白孔(只含细胞培养基)。分别于0、24、48及72 h每孔加入5 μL CCK-8溶液，5％CO2及饱和湿度培养基继续孵育2 h,检测450 nm光谱下的吸光度，根据标准曲线用吸光值计算细胞数量，绘制细胞增殖曲线图。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 重组质粒pEGFP-N1-Kiss-1的测序鉴定

经上海吉凯基因化学技术有限公司的序列测定分析，显示合成的目的基因Kiss-1序列完全符合Gene Bank中Kiss-1 cDNA的序列(图1)。

2.2 SW480细胞转染质粒及筛选

SW480细胞转染质粒后24 h,在荧光显微镜下观察细胞，可见绿色荧光。经过4周的G418筛选，G418维持浓度为300 μg/mL,视野里几乎所有细胞都带有绿色荧光蛋白。停用G418一周，荧光显微镜下观察绿色荧光基本保持不变。稳定转染细胞株筛选成功。

2.3 Western blot检测Kiss-1在SW480细胞中的表达

提取SW480、SW480-pEGFP-N1和SW480-Kiss-1细胞中总蛋白，Western blot检测Kiss-1蛋白kisspeptin的表达，可见kisspeptin在实验组的SW480细胞中高表达，而在空白对照组及阴性对照组的SW480细胞中表达量低。结果表明，Kiss-1基因在SW480-Kiss-1细胞中能稳定、高效表达。

2.4 CCK8法检测各组细胞的增殖能力

图1 目的基因Kiss-1的测序图谱位点72-489区间为目的基因序列

运用CCK8法检测Kiss-1对SW480细胞的增殖情况的影响。分别于种板0、24、48、72 h加入CCK8试剂，孵育2 h,用酶标仪测定各组细胞的450 nm波长吸光值(OD值)，绘制细胞增殖曲线。结果显示，培养24 h时各组细胞增殖能力间差异无统计学意义(P>0.05)。48 h后，随着培养时间延长，实验组细胞增殖能力明显低于对照组(P<0.05)。而空白对照组与阴性对照组间细胞增殖能力无明显差异(P>0.05)(图2)。

图2 CCK8法检测Kiss-1对SW480细胞增殖能力的影响

3 讨 论

肿瘤的发生发展与细胞恶性增殖密切相关，细胞增殖失控级凋亡异常导致肿瘤细胞寿命延长。多种癌基因与抑癌基因参与肿瘤的发生与发展过程。Kiss-1是近来颇受关注的一种抑癌基因，其基因结构由四个外显子区域组成，外显子Ⅰ与外显子Ⅱ为非编码区，外显子Ⅲ的结构依次为翻译起始位点、38个非编码碱基、及103个编码碱基，外显子Ⅳ含335个翻译碱基、翻译终止点、多腺苷酸化信号和121个非编码碱基。先前有学者研究表明其对胃癌、肾细胞癌等多种人类恶性肿瘤有转移抑制作用[3-5]。同时在小细胞肺癌、骨肉瘤、胃癌等肿瘤细胞增殖过程中，Kiss-1也发挥着负性调节作用[4,6-7]。同样地，对鼻咽癌、肝癌患者的研究显示，低表达Kiss-1的患者恶性程度更高，患者的预后明显落后于高表达Kiss-1的患者，而Kiss-1表达水平高的肿瘤患者，肿瘤发展慢，预后相对较好[8]。国内外亦不乏学者对Kiss-1基因与结肠癌组织进行研究。Liang等[9]通过免疫组织化学方法发现，Kiss-1基因与结肠癌的分级、分期、肿瘤大小及淋巴结转移存在一定的关联性，提出Kiss-1对诊断结肠癌、判断其预后具有重要的潜在意义。本研究通过构建pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒，成功将Kiss-1重组质粒转染SW480细胞。CCK8实验证实SW480细胞的体外增殖能力从细胞周期的48h开始显著下降，实验组细胞生长速度较阴性对照组及空白对照组明显减慢，差异有统计学意义。因此，推测Kiss-1基因能有效抑制结肠癌SW480细胞的增殖能力，从而影响结肠癌的发生、发展。

肿瘤的发生是多种基因共同作用的多步骤、多阶段的过程，很多研究结果显示Kiss-1基因的表达与多种肿瘤的增殖、浸润、转移密切相关，然而其在肿瘤的发生发展中的具体作用机制有待进一步研究。

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