一例罕见B(A)血型的基因鉴定

李慧敏，林隽峰，张 帆，顾玉微，顾 萍，傅启华，王 静

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海200127)

ABO血型系统中，除正常ABO血型外，还存在一些抗原性较弱的亚型。B(A)血型是一种比较罕见的亚型，据报道B(A)血型在欧洲高加索人种中发生频率非常低，约为1/(17～18)万[1]，也有文献粗略计算过，B(A)血型在我国北方献血员中的发生频率可能为1/(5～10)万，远高于欧洲人种[2]。而其实际发生频率尚待调查。其血清学表现为红细胞表面携带正常的B抗原和少量的A抗原，以及和O型红细胞相等量的H抗原，血清中可检测到抗A抗体。我们在日常血型鉴定中，发现1例血清学鉴定困难者，经基因鉴定为B(A)04/O06血型。

材料和方法

一、研究对象

患儿，女，8个月龄，拟手术入上海儿童医学中心儿外科，术前血型血清学检查发现ABO血型正反定型不符。患儿血培养呈阴性，输血相关传染病指标检查均呈阴性。采集患儿静脉血标本，以0.109 mol/L柠檬酸钠1∶9抗凝，用于抽提DNA，－80℃冻存。

二、仪器与试剂

WADiana/8XT全自动血型仪、DG Gel Confirm卡、DG Gel Neutral卡及DG Gel Coombs卡由西班牙Diagnostic Grifols，S.A公司生产。抗球蛋白试剂、单克隆抗A抗体、单克隆抗B抗体、ABO细胞、抗体筛查细胞由上海血液生物医药有限责任公司生产。TIANamp Blood DNA Kit、Universal DNA Purification Kit及TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒由北京天根生化科技有限公司生产。pGEM-T Easy Vector SystemⅠ试剂盒由Promega公司生产。引物设计参照NCBI GenBank中ABO基因序列(序列号FR828573.1)，由华大基因生物技术有限公司合成，引物序列见表1。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增试剂由C-TaKaRa公司(大连宝生物)生产。

三、血型血清学试验

1.微柱凝集法 用微柱凝集法进行血型鉴定、直接和间接抗球蛋白试验、抗体筛查，试验方法按照公司提供的操作手册进行。

2.试管法 用试管法进行血型鉴定、经典抗球蛋白试验、抗体筛查。试验方法按照《全国临床检验操作规程》(第3版)[3]进行。

四、基因鉴定

1.PCR扩增与测序 提取患者外周血基因组DNA，进行 PCR扩增反应，反应总体积25μL，包括 Taq DNA 聚合酶(10 mmol/L)0.2μL，10×缓冲液2.5μL，10 mmol/L dNTP 2μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1μL，DNA 模板 1μL、H2O 17.3μL。扩增条件:95℃ 5 min，然后95℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，35 个循环，72℃ 5 min。PCR产物经割胶纯化后直接测序，所用仪器为ABI 3730 DNA测序仪。

表1 ABO血型基因鉴定Exon6和Exon7引物序列

2.PCR产物的克隆与测序 (1)PCR产物的扩增与纯化。合成克隆引物，见表1，PCR反应总体积50μL，包括Taq DNA聚合酶(10 mmol/L)0.5μL，10×缓冲液5μL，10 mmol/L dNTP 4μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 2μL，DNA 模板2μL、H2O 34.5μL。扩增条件:95 ℃ 5 min，然后95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃ 5 min。PCR产物经胶纯化回收;(2)PCR产物的克隆。进行连接反应，连接体系如下:2×缓冲液 5μL，pGEM-T Easy载体1μL，T4 DNA 连接酶 1μL，PCR 产物 1μL。连接条件为25℃连接4 h。取10μL连接产物按常规步骤转化感受态大肠埃希菌，铺于含氨苄西林、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷和 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB琼脂糖平板上，37℃过夜，次日随机挑取数个白色单一菌落分别在LB培养液中振荡过夜，扩增后提取质粒，送测序。

结 果

一、血型血清学试验结果

试管法中，患儿红细胞与单克隆及人源抗A抗体反应均呈阳性(++)，与单克隆及人源抗B抗体反应均呈强阳性(++++)，与单克隆抗H抗体反应呈强阳性(++++)，见表2。同时将O细胞、B细胞与抗H抗体反应作为对照，分别呈强阳性(++++)和阳性(+)。

表2 患儿的血型血清学试验结果

二、基因鉴定结果

对患儿DNA的第6、7外显子及其侧翼序列进行基因测序，并进行PCR产物的克隆与测序，其结果与Blood Group Antigen Gene Mutation Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi cmd=bgmut/systems_info＆system=abo)进行比较。以A101为标准序列，发现存在碱基位点的变异，见表3。由于6号外显子存在移码突变，故同时将其进行反向测序。通过ABO基因第6、7外显子序列分析最终确定其基因型为B(A)04/O06。并通过PCR产物的克隆测序发现多态性位点 261del、c.646T＞A、c.681G ＞A、c.771C ＞ T、c.829G ＞ A 位于同一等位基因，多态性位点 c.297A ＞G、c.526C ＞G、c.657C ＞ T、c.703G ＞ A、c.796C ＞ T、c.803G ＞ C、c.930G＞A及突变位点c.640A＞G位于另一等位基因。见图1。

表3 E6和E7中的变异位点

图1 患者ABO基因第6和第7外显子测序结果

讨 论

ABO血型存在3个等位基因，分别是A、B和O，定位于染色体区域9q34.2，其中A等位基因(α-1，3N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因)和B等位基因(α-1，3半乳糖基转移酶基因)编码354个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白质具有糖基转移酶活性，能将相应的糖基连接到前体物质H抗原上，形成A和B抗原。而ABO亚型的出现主要是由于糖基转移酶基因第6和第7外显子基因位点发生了突变，减低或改变了酶的活性，导致红细胞上表达的A或B抗原的种类或数量发生改变，血型血清学正反定型不符。最新文献报道，ABO基因上游启动子的一段碱基缺失(-35_-18del)与ABO亚型有关，该文献作者认为可能是由于启动子的碱基缺失影响到转录因子与其结合，使启动子的转录活性降低，进而影响到糖基转移酶的活性[4]。

B(A)血型是一种罕见的ABO亚型，人群中发生频率非常低，最早发现于1985年[5]，国内首先采用分子诊断技术所做的类似研究最早见于2004年[6]。而本研究所报道的由nt640A＞G所引起的B(A)04型等位基因则在2005年第1次报道[7]。B(A)血型红细胞上含有少量A抗原活性和接近正常的B抗原特异性，H抗原含量接近O型细胞但明显高于正常B型细胞，B(A)血清中含有的抗A，可以凝集A1细胞和部分A2细胞，因此血清学表现为血清中含抗A且红细胞抗原呈AB型(A弱B强)[8]。目前认为，B(A)亚型的产生可能是正常B等位基因发生的单碱基突变，导致变异的B基因具有编码双功能活性酶的能力[2]，因此，血清学表型除了表现几乎正常的 B抗原特异性外，还表现少量A抗原特异性，且其红细胞上H抗原含量接近O型红细胞，强于正常B型细胞，具有较强的H抗原[7]，此点在我们所做对照实验中也得到证实。

目前报道的B(A)亚型共6种，为B(A)01～06，国内报道的B(A)亚型多为B(A)02(c.700C＞G)、B(A)04(c.640A ＞ G)以及 B(A)05(c.641T ＞C)。其中 B(A)04(c.640A ＞ G)和 B(A)05(c.641T＞C)均导致第214位氨基酸的改变，前者由甲硫氨酸(Met)变为缬氨酸(Val)，后者则变为苏氨酸(Thr)。此外，B型的另一亚型即Bel01亚型也涉及到214位氨基酸的改变，与前两者不同的是Bel01亚型是在nt641位发生了T＞G的改变，相应地导致糖基转移酶第214位氨基酸由Met改变为Arg，上述3种亚型均由同一位置的氨基酸改变所引起，但是Bel01亚型却有着和B(A)亚型不一样的血型特点，表现为红细胞表面含有少量B抗原活性，H抗原含量接近O型红细胞，但明显高于正常B型细胞。有趣的是，214位氨基酸若为Met，则表现为B101血型特点;若为Val，则表现为 B(A)04特点;若为 Thr，则表现为B(A)05的特点;若为Arg，则表现为Bel01的特点。且除了Arg为碱性氨基酸外，其它均为中性氨基酸，由此推断糖基转移酶的214位氨基酸是非常关键的位点，可能处于糖基转移酶的活性结构域，决定糖基转移酶的种类和活性，以至于同一位置不同种类和不同性质的氨基酸置换导致血清学表型出现巨大差异。关键核苷酸位置上的突变及其引起的单个氨基酸位置上的变化，完全有可能改变糖基转移酶的酶学特点和催化活性，使同一底物催化形成不同的产物[9]。

本例报道的为B(A)04/O06亚型，理论上B(A)血型个体绝大多数基因型应该是B(A)/O的杂合型，但亦出现过B(A)/A1型的报道[9]。而B/B纯合型也有过报道[2]，为同时具有B(A)02型等位基因和B101型等位基因，可能表达部分正常的 B型抗原并同时具有一些B(A)血型特征。

血型基因分型技术作为一种分子诊断技术，是在分子生物学技术的快速发展中建立起来的，与血型血清学实验相比，它具有很多的优点和长处，其优势主要体现在不受血清中自身抗体、不规则抗体的影响;其次，不受受检者自身所患疾病的影响。当遇到临床血清学血型鉴定困难时，血型基因分型的快速性和准确性更使其可以作为解决这类问题的首选方法。因此，基因分型法具有血清学无法比拟和不可替代的优势。

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