ROC曲线对ELISA检测丙型肝炎抗体阳性判断值的确定和分析

唐 婧，包建玲，孟存仁，张朝霞

(新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，新疆乌鲁木齐830054)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎呈全球分布，大约有1.7亿人为HCV感染者，占世界人口的3%，且发展中国家高于发达国家[1]。丙型肝炎病毒抗体(抗HCV)是目前应用最广泛的用于流行病学调查、临床丙型肝炎患者筛查和诊断的检测项目，为丙型肝炎的早发现、早治疗提供了可靠的依据[2]。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是抗HCV检测最常用的方法。在免疫定性测定中，确定合适的阳性判断值(Cut-off值)对减少假阳性和假阴性，确保试验的敏感性和特异性具有重要意义[3]。研究表明受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线是设定 Cut-off值的最佳方法[4]。我们采用ROC曲线确定实验室两种不同酶免分析系统检测抗HCV的最佳Cut-off值，以提高ELISA检测抗HCV的敏感性和特异性。

材料和方法

一、研究对象

使用盲法收集2013年3月至2013年5月新疆医科大学第一附属医院医学检验中心血清标本202份，分离血清，置－80℃保存待测。标本来源对象年龄1～82岁，男93例，女109例，其中132份来自肝病科门诊和住院患者、70份来自普通门诊患者和体检者。

二、仪器与试剂

addcare ELISA 1100全自动酶免分析系统(简称ddcare ELISA 1100，烟台生物科技有限公司);TECAN加样系统(瑞士帝肯公司);FAME后处理系统(瑞士哈美顿公司)。抗HCV确证试剂盒[重组免疫印迹法(recombinant immunoblot assay，RIBA)]由北京万泰生物药业股份有限公司提供(批号为RC20130101);抗HCV诊断试剂盒由(ELISA)北京万泰生物药业股份有限公司提供(批号为C20130406)。所有试剂均在有效期内使用，按说明书操作。

三、方法

1.标本检测 对－80℃保存待测的202份血清标本分别用上述指定厂家的抗HCV诊断试剂(ELISA)和抗HCV确证试剂(RIBA)进行抗HCV测定和抗HCV确认，记录吸光度(A)值，其中ELISA分别用addcare ELISA 1100和TECAN+FAME组合酶免分析系统(简称TECAN+FAME酶免系统)进行检测。检测前两种系统均进行了校准和性能验证。

2.RIBA确认结果判定 条带强度的判读和结果的解释见表1和表2。

表1 RIBA抗HCV反应条带强度的判读标准

表2 RIBA抗HCV反应结果的判读标准

3.质量控制 ELISA检测每一批分别设定2个阴性对照、2个阳性对照和1个质控，其中阴性对照孔A值≤0.08，阳性对照孔A值≥0.50，否则实验无效，质控孔S/CO值在2.39～4.96的范围内。RIBA检测每一批分别设定1个阴性对照和1个阳性对照，其中阴性对照出现对照线-1和对照线-2，阳性对照出现 Core、NS3、NS4-1、NS4-2、NS5、对照线-1和对照线-2，且每条试验结果中对照线-1和对照线-2均必须出现，如果对照线-1和对照线-2均不出现或仅出现1条，则此条的检测结果无效。试验均有良好的质量控制。

4.Cut-off值的验证 EP12-A文件Cut-off值的验证方法:(1)准备具有临界值浓度和浓度在临界值±20%的标本，标本的量要充足，以保证同一份样本能重复测定20次;(2)重复测定每个标本20次，计算出每个标本的阴性和阳性百分比;(3)估计的临界值是否准确，如果准确，同一份样本重复测定的结果应该有50%阳性和50%阴性结果;(4)临界值±20%的浓度范围是否位于该实验方法的“95%区间”，当临界值+20%浓度的标本检测阳性率≥95%，且临界值－20%浓度的标本检测结果阴性率≥95%，则该浓度范围≥该方法95%区间;此时，标本浓度在临界值±20%浓度范围之外就能得到稳定的检测结果。

四、统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。用抗HCV A值做ROC曲线，计算曲线下面积，并探讨其最佳临界值即约登指数最大时的Cut-off值，且约登指数为敏感性与特异性之和减去1，从而确定抗HCV诊断价值最大时的Cut-off值。用配对四格表卡方检验探讨ROC曲线确定的两种不同酶免分析系统ELISA检测抗HCV最佳Cut-off值下的检测结果的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、RIBA确认检测结果

RIBA检测结果为阳性142份，阴性60份。其中142份RIBA阳性标本5个抗原区条带强度分布情况见表3。142份RIBA阳性标本中，Core蛋白、NS3蛋白、NS4-1蛋白、NS4-2蛋白和NS5蛋白阳性的分别有142份、141份、80份、16份和68份，其中强度为2+的分别有125份(88%)、121份(85%)、61份(43%)、9份(6%)和 56份(39%)，强度为1+的分别有17份(12%)、20份(14%)、19份(13%)、7份(5%)和12份(8%)。

表3 142份RIBA阳性标本5个抗原区条带强度分布情况

二、ROC曲线分析结果

以RIBA检测结果为参照，绘制两种酶免分析系统不同阳性判断值的ROC曲线。addcare ELISA 1100检测抗 HCV的最佳 Cut-off值为0.448，敏感性为 99.3%，特异性为 96.7%，约登指数为0.960，ROC 曲线下面积为 0.998，见图 1。TECAN+FAME酶免系统检测抗HCV的最佳Cut-off值为 0.406，敏感性为 99.3%，特异性为96.7%，约登指数为 0.960，ROC 曲线下面积为0.998，见图2。两种系统不同临界值时的敏感性和特异性见表4和表5。对比两种系统采用ROC曲线确定的最佳Cut-off值下的抗HCV检测结果，差异无统计学意义(P=1.000)。见表6。

图1 addcare ELISA 1100检测抗HCV的ROC曲线图

图2 TECAN+FAME酶免系统检测抗HCV的ROC曲线图

表4 addcare ELISA 1100不同临界值下的敏感性和特异性

表5 TECAN+FAME酶免系统不同临界值下的敏感性和特异性

表6 两种系统检测抗HCV的最佳Cut-off值下的检测结果 (例)

三、Cut-off值的验证结果

addcare ELISA 1100检测抗HCV的最佳Cutoff值为0.448。一个 A值约为0.448的标本重复测定20次获得50%阳性结果和50%阴性结果。一个A值约为0.538(临界值+20%)的标本重复测定20次获得的阳性率为95%。一个A值约为0.358(临界值－20%)的标本重复测定20次获得的阴性率为100%。

TECAN+FAME酶免系统检测抗HCV的最佳Cut-off值为0.406。一个A值约为0.406的标本重复测定20次获得50%阳性结果和50%阴性结果。一个A值约为0.487(临界值+20%)的标本重复测定20次获得的阳性率为95%。一个A值约为0.325(临界值－20%)的标本重复测定20次获得的阴性率为100%。

讨 论

ELISA是目前临床检验中应用较为广泛的一种检测方法，其判断测定结果的依据主要依靠所谓的“阳性判断值”，即Cut-off值。虽然各厂家生产的ELISA试剂盒均提供Cut-off值的计算方法，但不同批试剂盒使用相同Cut-off值。多年使用同一Cut-off值的现象普遍存在，这显然存在不合理性。由于试剂盒生产工艺的不均一性，各批试剂盒的反应效果不尽相同，所得的Cut-off值应当不同。此外，环境温度、加样体积误差、洗板效果等方面均是影响ELISA检测性能的因素。为此，各实验室需自行设定并计算适合本实验室的Cutoff值[5]。

本研究中的两种系统(addcare ELISA 1100和TECAN+FAME酶免系统)虽然使用同一种抗HCV诊断试剂盒，但是addcare ELISA 1100是加样、后处理一体机，有2个工作舱(前、后舱自动转板，避免污染)和3台独立洗板机(前后舱均可使用，每台洗板机均为96针洗板头，洗板强度大、效果好)，开放操作(易受环境温度干扰);TECAN+FAME酶免系统是TECAN加样系统和FAME后处理系统组合的酶免分析系统，人为转板，易污染，2台洗板机(每台洗板机均为24针洗板头，洗板效果较差)，后处理机内部操作(受环境温度干扰小)。针对以上不同点，本实验室有必要分别确定两种系统ELISA各自的检测抗HCV的Cutoff值。

Cut-off值的设定方法一般有标准差比率、测定标本对阴性比值、以阴性对照均值±2s或3s、百分位数法、双质控、ROC曲线等[4]。不同的方法设定的Cut-off值有一定的差异，但都要综合考虑假阳性率和假阴性率。在各种Cut-off值的计算方法中，ROC曲线法已得到了实验室的认可[6]。该方法考虑了每一个可能的Cut-off值，因而能够更客观地评价诊断试验的诊断价值和确定最佳临界值。

本研究通过ROC曲线确定addcare ELISA 1100检测抗HCV的最佳Cut-off值为0.448，敏感性为 99.3%，特异性为 96.7%，约登指数为0.960，ROC 曲线下面积为0.998;TECAN+FAME酶免系统检测抗HCV的最佳Cut-off值为0.406，敏感性为99.3%，特异性为96.7%，约登指数为0.960，ROC 曲线下面积为0.998。

伍建宁等[7]研究通过对5 709份无偿献血者标本的抗HCV ELISA检测的A值的统计和RIBA检测，确认Cut-off值以0.112为宜，与本研究所确定的Cut-off值(0.448和0.406)相差较大。其原因可能有:(1)Cut-off值的设定方法不同，伍建宁等[7]的Cut-off值的设定方法为百分位数法单侧99%，本研究Cut-off值的设定方法为ROC曲线法;(2)仪器与试剂不同，伍建宁等[7]使用Genesis RSP-200型全自动标本处理系统加样，德国BEPⅢ全自动酶标仪进行后处理及检测，本研究分别使用 addcare ELISA 1100和 TECAN+FAME酶免系统检测，伍建宁等[7]研究抗 HCV ELISA测定试剂盒购自厦门新创生物工程公司，抗HCV RIBA 3.0SIA确认试剂盒购自美国Chiron公司，本研究抗HCV ELISA测定试剂盒和抗HCV RIBA确认试剂盒均购自同一家公司;(3)标本来源不同，伍建宁等[7]研究标本来自5 709份无偿献血者，本研究标本来自202份临床检测者。采供血系统血液筛检抗HCV，Cut-off值的设定应略低于临床抗HCV检测，这对于减少HCV的经输血传播具有重要意义[7]。

抗HCV诊断试剂盒说明书上提供的Cut-off值的计算公式为临界值=阴性对照孔A均值+0.12(不足0.02按0.02计算)。因此通常情况下所计算出的Cut-off值为0.140，与本研究所确定的Cut-off值(0.448和0.406)相差较大。若按照说明书上提供的Cut-off值判断阴性和阳性标本，虽然敏感性较高，但是特异性较低，即易出现假阳性。再者，由于ELISA方法学上的缺陷，抗HCV检测出现假阳性的原因有:(1)高球蛋白血症[4];(2)类风湿因子(RF)的干扰，如血清或血浆标本中存在RF，则其可与固相上的IgG和酶标记的IgG结合，从而出现假阳性反应;(3)标本中超氧化物歧化酶的干扰;(4)用于固相包被的HCV基因工程抗原不纯[8];(5)试剂保存、运输等环节的影响[9]。因此会增加临床抗HCV检测的误诊率。若按照本研究确定的Cut-off值判断阴性和阳性标本，虽然敏感性降低，但是特异性升高，即易出现假阴性。抗HCV检测出现假阴性的原因有:(1)HCV感染后到抗体的出现有一个较长的窗口期(平均为6～12周)[10];(2)HCV 感染的其它阶段。因此会提高临床抗 HCV检测的漏诊率。ELISA技术本身在Cut-off值的设置上存在局限性，也就是说在Cut-off值周围一定区域内，测定结果难以明确判断是阴性还是阳性，即所谓的灰区，而这个灰区到底有多大，在国内使用的ELISA试剂盒中均无说明。这种一刀切的判断方式所得到的结果存在假阴性的可能[7]。

综上所述，虽然从理论上而言，ROC曲线是设定Cut-off值的最佳方法，但是由于ELISA测定通常有较大的变异，其每次测定的Cut-off值都会有所差异，因此需要控制Cut-off值的批间变异，但在实际应用中有一定的局限性[3]。因此，综合抗HCV诊断试剂盒说明书上提供的Cut-off值(0.140)和经ROC曲线确定的两种系统的Cut-off值(0.448和 0.406)的诊断性能，将本实验室addcare ELISA 1100和TECAN+FAME酶免系统检测抗HCV的“灰区”分别设定为0.140～0.448和0.140～0.406。对于ELISA检测抗HCV中的“灰区”结果，最好采用较为敏感和特异的方法进行复检，以免误诊和漏诊。有条件的实验室可以用确认试验对结果进行确认。

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