模拟酸雨与Cd对紫萼膜脂过氧化及形态特征的影响

王成聪，高素萍，黄丽，林啸，张硕，雷霆

（1.四川农业大学风景园林学院，四川 成都611130；2.四川农业大学园林研究所，四川 成都611130）

＊植物是城市污染物的一个重要的汇［1］。快速城市化导致城市污染加剧，城市植被生态服务功能下降。研究城市环境与城市植被间的相互作用，特别是城市环境污染对城市植被的生态胁迫效应已显得尤为重要。自然状态下，绝对意义上的单一污染是不存在的，污染多具伴生性和综合性［2］，各因素间可能会产生加和、协同或拮抗等作用。酸雨可以影响土壤中重金属的化学行为，二者共同导致植物生存条件进一步恶化［3］。虽然目前酸雨和重金属污染对植被生态胁迫效应的研究已得到充分重视，但多数研究集中在单一酸雨或重金属对植被的胁迫方面，且局限于单因素水平变化产生的表面效应。酸雨与重金属复合污染的研究主要集中于农作物方面，且并不区分各胁迫因子对总体胁迫效应的贡献程度［4］。

紫萼（Hostaventricosa）是百合科玉簪属多年生草本植物，生物量大且易于繁殖和养护，已在城市绿化中推广应用。目前，紫萼的相关研究主要集中在Pb胁迫［5－6］方面，有关Cd和酸雨单一或复合污染对紫萼影响的相关研究尚未见报道。那么，在酸雨与Cd复合污染的共同作用下，紫萼植株体内的膜脂过氧化及形态的变化特征，以及这种变化到底是酸雨与Cd伤害效应的简单加和，还是二者协同或拮抗作用所致尚不得而知。基于这样的假设和疑问，人工模拟酸雨与重金属Cd的复合污染条件，研究其对紫萼植株形态特征与膜脂过氧化方面的影响，比较单一与复合污染对植物的不同影响，确定二因素间的相互作用类型，并区分各胁迫因子对总体胁迫效应的贡献程度，讨论引起表面效应的微观过程，找出引起植物受害的污染强度阈值，以期为城市绿化净化植物材料选择与城市植被生态系统修复等实践提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料选择三年生紫萼实生苗，为2010年3月种子萌发所得，种子采自雅安市碧峰峡大熊猫基地。选取其中长势良好且基本一致的实生苗，于2012年10月提前转移至四川农业大学成都校区苗圃顺利越冬。

1.2 配制盆土

将采集的土壤（园土）和腐殖土自然风干，碾碎并剔除杂物后进行研磨，过5mm筛，二者按比例1∶1混合均匀，用80%多菌灵1000倍液消毒，密封堆放30d备用。混合土基本理化性质如下：pH值6.5，Cd背景含量为0.466mg／kg，全氮（N）0.68g／kg，全磷（P）0.55g／kg，全钾（K）3.24g／kg，有机碳（C）36.49g／kg，阳离子交换量（CEC）17.83cmol／kg。

1.3 外源Cd处理

根据国家土壤环境质量标准和成都平原重金属污染情况，并通过一系列预试验，最终确定盆土5个Cd浓度梯度分别为0，10，30，50，100mg／kg（以Cd2＋离子含量计）。其具体配制方法如下：用分析天平称取20.3149g分析纯试剂CdCl2·2.5H2O，用超纯水（RO）定容至1L的容量瓶配成母液备用。处理时，用量程为5000μL的移液枪分别吸取母液0，1000，3000，5000，10000μL，定容至5个200mL的容量瓶中，制成每瓶分别含有0，10，30，50，100mg的Cd污染处理液（以Cd2＋离子含量计）。由于试验中每盆称取的混合土重为2kg，故每个梯度浓度的Cd处理液需重复喷淋加入1次。其中，以不添加Cd2＋的土壤作为对照（CK）。

1.4 模拟酸雨处理

模拟酸雨溶液的配制参照麦博儒等［7］的方法并加以改进，根据成都市温江区气象局提供的气象观测资料，参考成都市近年来的降水主要离子组成及浓度［8］，同时考虑到自然降水离子浓度的不确定性以及试验的可操作性，通过计算最终确定模拟酸雨溶液中各主要离子浓度（表1）。

表1 模拟酸雨各主要离子成分Table 1 Main ion concentrations of the mixed simulated acid rain μmol／L

精确称取分析纯试剂CaCl2（1.6225g）、（NH4）2SO4（1.0228g）、MgSO4·7H2O（0.6581g）、KNO3（0.3508 g）、NaF（0.1122g），用超纯水分别定容至100mL容量瓶制成浓溶液，用量程为1000μL移液枪分别吸取浓溶液1mL，再用超纯水分别定容至100mL容量瓶作为稀释液，然后将5种稀释液依次加入1L容量瓶中混匀，用超纯水定容至刻度线；再以0.05mol／L稀盐酸溶液进行pH 值分别为6.5，5.5，4.5，3.5，2.5的标定，即为试验所用的模拟酸雨处理液。CaCl2和稀盐酸的加入也意味着有一定数量的Cl－加入，但每次喷施的Cl－总量（10－6mol数量级）与土壤中Cl－相比较少，且低浓度Cl－不会对植物产生毒害作用。各处理离子组成浓度最终以ICS－2100离子色谱仪（DIONEX，Sunnyvale，USA）测定为准。

酸雨的临界pH为5.6，各酸雨梯度pH 分别模拟极强酸雨（extreme AR，pH＝2.5）、强酸雨（strong AR，pH＝3.5）、较强酸雨（moderate AR，pH＝4.5）、弱酸雨（weak AR，pH＝5.5）以及对照（CK，pH＝6.5）。用小型喷雾器仿照自然降水，每隔3d分别喷淋1次各pH模拟酸雨溶液，每次每盆100mL。

1.5 试验方法

试验采用二因素五水平完全随机试验设计，共25个处理组合（表2）。每个处理组合重复3次，即75盆，每盆栽2株，共150株紫萼。

2013年3月28日，随机选择长势良好且相近的三叶期紫萼，剪去腐烂的根系，用清水冲洗干净后蘸取80%多菌灵800倍液消毒后，栽植于20cm×15cm×15cm盆中，每盆称取2kg混合土。花盆下衬垫托盘，将土壤渗出液倒回盆内，以防止土壤中重金属Cd流失。分株15d后，待苗木长势恢复良好后即开始试验处理。大棚内外温湿度基本一致，遮阴网遮光率为85%。

表2 Cd和模拟酸雨复合处理组合Table 2 The treatment combination of Cd and simulated acid rain

1.6 指标测定

处理30d后，测试鲜样随机采自每个处理植株的第3～5片叶，采用打孔法从每株紫萼取3个样本来进行各生理指标的测定。由于紫萼叶片可见伤害的出现明显滞后于其他生理指标，故该指标的测定安排到试验的后期进行，以印证试验前期各生理指标对Cd和酸雨复合污染的响应，具体取样时间为处理后的第60天。

1.6.1 可见坏死百分比 叶片图像由数码相机Canon IXUS 130拍摄，叶片坏斑点的总面积以及总的叶面积均由软件Adobe Photoshop 3.0统计，可见坏死百分比表示为坏死面积与总叶面积的百分比，详见肖强等［9］的方法。

1.6.2 MDA和ROS（活性氧）含量 MDA测定参照李合生［10］的方法。H2O2测定参照Patterson等［11］的方法；测定采用高俊凤［12］的方法。

1.6.3 SOD和CAT活性 SOD活性测定采用NBT光还原法［10］；CAT活性测定采用紫外吸收法［10］。

1.7 数据处理

用SPSS 20.0软件进行数据分析。采用两因素方差分析（Two－way ANOVA）检验处理的显著性；用LSD法进行处理间多重比较；用Pearson相关分析法来评价相关显著性。用Microsoft Excel 2010制作图表。

2 结果与分析

2.1 模拟酸雨与Cd复合胁迫对紫萼植株形态的影响

如图1，单一酸雨下，pH≥4.5时紫萼叶片几乎没有伤害症状；pH在2.5～3.5时，叶片才出现受害症状，虽与对照差异达到显著水平（P＜0.05），但受害面积都在5%以下，说明紫萼是一种对酸雨抗性较强的植物。单一Cd处理下，浓度30mg／kg是一个转折点，开始出现明显的可见伤害，可见坏死百分比随Cd浓度增加而增大，处理间差异均达到显著水平（P＜0.05）。通过对主效应和交互作用进行分析可知，酸雨与Cd交互作用显著（P＜0.05），更多地表现为协同作用。这种伤害作用在酸雨pH≥4.5以及Cd浓度≤30mg／kg水平下并不明显，在酸雨pH≤3.5以及Cd浓度≥30mg／kg水平下，这种伤害明显大于两因素各水平伤害的简单加和。Cd是本试验中造成叶片坏死的主要贡献者，酸雨pH＝2.5和Cd浓度30mg／kg是对紫萼造成可见伤害的临界值。

图1 模拟酸雨与Cd复合污染对紫萼叶片的可见伤害以及对MDA含量的影响Fig.1 Combined effects of Cd and Simulated acid rain on the visible damage and the MDA content in leaves of H.ventricosa

2.2 酸雨与Cd复合污染对紫萼质膜过氧化的影响

图2 模拟酸雨与Cd复合污染对紫萼ROS产生量的影响Fig.2 Combined effects of Cd and simulated acid rain on the ROS content in leaves of H.ventricosa

2.3 模拟酸雨与Cd复合污染对紫萼抗氧化酶活性的影响

总体来看，随Cd和酸雨污染强度的增加，紫萼叶片中SOD和CAT活性变化趋势明显，都表现为先增加后下降的趋势（图3）。单一酸雨下，随pH的下降，SOD和CAT活性明显增加，pH为3.5和2.5时处理差异显著。单一Cd处理下，SOD和CAT活性随Cd浓度的增加都呈单峰型曲线，CAT活性达到峰值的浓度为30mg／kg，低于SOD的50mg／kg，说明CAT活性对Cd污染更为敏感。复合处理下，酸雨pH≤5.5时SOD活性在Cd浓度为30mg／kg处即达到最大值；在pH为6.5时，SOD活性在50mg／kg处达到最大值。酸雨和Cd两因素间交互作用显著，Cd是造成叶片紫萼叶片中SOD和CAT活性变化的主要因素。

图3 模拟酸雨与Cd复合污染对紫萼SOD和CAT酶活性的影响Fig.3 Combined effects of Cd and simulated acid rain on the SOD and CAT activity in leaves of H.ventricosa

3 讨论

叶片可见伤害是逆境胁迫危害的最直观证据。紫萼对酸雨有一定的耐受性，只有在强酸雨下才表现出较轻的可见伤害，这与 Chen等［13］对木荷（Schimasuperba）与枫香（Liquidambarformosana）的研究结果一致。在Cd的复合作用下，酸雨与Cd产生了协同作用，加重了对紫萼叶片的伤害，但Cd浓度较低时可见伤害仍不明显。酸雨pH＝2.5和Cd浓度30mg／kg是对紫萼造成可见伤害的临界值，生理指标的这一临界值会提前显现，说明生理指标对复合污染指示更为灵敏。

植物细胞质膜是细胞与外界进行物质能量交换的界面，逆境胁迫对植物的伤害首先作用于质膜，产生对细胞质膜有害的ROS。植物的受害程度与ROS积累密切相关，ROS过量积累会导致质膜过氧化加剧［14］。随污染强度的增大，O2－·产生速率、H2O2含量随之显著升高，与Cd浓度呈极显著正相关，表明高强度复合污染加剧了紫萼体内自由基的量态，使植物遭受到更严重的伤害。Cd能使光呼吸系统功能紊乱，导致活性氧的产生，还可诱导NADPH氧化酶活性提高，促进NADPH氧化，致使ROS大量生成［15］。

ROS产生量的变化情况，与SOD和CAT活性变化密切相关。正常情况下，植物体内有一套完整的ROS清除系统，抗氧化酶是其重要组成部分。在遭受外界逆境的胁迫时，抗氧化酶能将ROS的产生与清除维持在较低的动态平衡状态，从而防止逆境胁迫对植物造成的ROS伤害。SOD是植物体内ROS防御系统的第一道防线，能催化超氧阴离子自由基歧化反应成为基态的分子氧和H2O2，并与CAT共同组成ROS防御酶系统［16］。如图3，正常紫萼体内SOD活性较稳定，ROS的产生与SOD的清除维持在动态的平衡状态。紫萼在遭受较弱酸雨与Cd复合污染时，随着胁迫强度的增加，体内产生的ROS会诱导SOD活性上升，从而大大增加了SOD对ROS的歧化能力，有效地清除ROS并防止逆境胁迫伤害。而当胁迫强度超过植物的耐受限度时，SOD活性便开始下降，CAT可以将H2O2催化分解为H2O和O2，其活性变化对植物体内膜脂过氧化平衡起着重要作用。图3的CAT活性变化表明，当胁迫强度较小时，CAT酶活性被激活，有效地清除了紫萼体内ROS代谢产生的H2O2；而当胁迫强度较大时，CAT活性严重受到抑制，并呈现出逐渐下降的趋势，最终导致H2O2的过量积累，对紫萼产生毒害作用。H2O2可以和过量的O2－·生成毒性更强的·OH，对植物造成更严重的伤害［17］。从SOD和CAT酶活性峰值出现位置来看，CAT对复合污染的敏感性明显高于SOD。

当植物体内ROS含量过多而不能及时被ROS防御酶清除掉时，便会导致ROS的逐渐积累，进而引发一系列膜脂过氧化反应，最终表现为质膜透性的变化［18］。MDA是一种高活性的脂质过氧化最终分解产物，能交联脂类、核酸、糖类及蛋白质，导致细胞质膜受损［19］。如图2，酸雨强度较大时，可以显著地促进膜脂过氧化反应，导致MDA含量上升。Cd含量与MDA含量呈极显著的正相关关系，这表明MDA含量可以很好地指示紫萼叶片细胞的脂质过氧化程度。氧自由基参与膜脂脱脂作用，在强氧化剂H2O2的作用下，通过Habe－weiss反应产生攻击力更强的·OH，启动膜脂过氧化，最终造成MDA含量增加［20］；或是因为ROS破坏生物功能分子如氨基酸、蛋白质、糖类，最终引起膜的过氧化作用，导致MDA含量增加［21］。试验中MDA含量的变化，可与O2－·产生速率、H2O2含量变化相互印证。

4 结论

1）酸雨和Cd复合污染比单一因素污染对紫萼造成的伤害大，二者间存在明显的交互作用，并非简单的加和作用，更多地表现为协同作用，高强度复合污染对紫萼的影响更大。2）紫萼对酸雨和Cd胁迫有较强的耐受性。相比而言，重金属Cd是复合污染下造成植物伤害的主要因素。3）酸雨pH＝2.5和Cd浓度30mg／kg是造成植物可见伤害的临界值，且生理指标比形态指标更为敏感，CAT活性对Cd污染胁迫响应比SOD敏感。

总之，无论是复合污染还是单一污染，紫萼都表现出较好的耐受性，出现一个明显的耐受阈值。这为酸雨与Cd复合污染地区的植物生态修复提供了一些可供参考的依据。

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