水杉种子GC/MS联用指纹图谱的建立

杨俊杰，王海燕，马俊义

(信阳农林学院 a.信阳市中药资源开发工程技术研究中心；b.信阳市中药分析检测重点实验室，河南 信阳464000)

水杉种子GC/MS联用指纹图谱的建立

杨俊杰a,b，王海燕a,b，马俊义a,b

(信阳农林学院 a.信阳市中药资源开发工程技术研究中心；b.信阳市中药分析检测重点实验室，河南 信阳464000)

采用水蒸气蒸馏法从10批水杉种子中提取挥发油，采用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)分析挥发油的主要化学成分及其相对含量，建立水杉种子的GC/MS指纹图谱。结果表明：水杉种子挥发油主要含有8个共有特征峰，各峰的相对保留时间基本一致（RSD＜0.5%），其相关系数（≥94%）、相似度（≥90%）、夹角余弦（≥95%）、相似性比（≥0.89）均达良好水平。本指纹图谱具有较好的特征性，能够反映产地差异情况，可用于水杉种子的质量鉴别。

水杉种子；挥发油；指纹图谱；气质联用技术

天然药物与人类的生存和生活密切相关，是人们预防和治疗疾病的重要武器。其中，木本植物是我国传统中草药的重要组成成分，常用的有厚朴[1]、杜仲[2]、肉桂[3]、五味子[4]等。目前，林源活性物质及天然功能成分已经成为天然药物开发的一个重要资源，受到广泛的重视。例如银杏功能活性成分提取分离技术[5]、油桐的药用价值研究[6]、黄连木的药用价值研究[7]等都取得不错的成果，活性成分如松科植物精油[8]、樟树根材的化学成分[9]等都取得了重要进展。水杉Metasequoia glyptostroboides作为一种常见的栽培树种，据中医药文献记载，其具有清热解毒、消炎止痛之功效，用于痈疮肿痛，藓疮等症[10]。笔者对水杉种子挥发油成分及抑菌作用进行了研究[11]，并对其抑菌机理[12]和抗氧化活性[13]进行了分析，认为其在抑菌剂和抗氧化剂开发方面有着广阔的应用前景。为了进一步挖掘水杉种子资源，特对其主要活性成分挥发油进行指纹图谱研究，为水杉种子药材的质量控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试植物水杉种子采集于2013年11月前后，1～8号样品来自河南信阳市浉河区，9号样品来自河南鸡公山自然保护区，10号样品来自河南省罗山县。经信阳农林学院周巍副教授鉴定为杉科植物水杉属水杉的成熟种子。乙醚、无水硫酸钠均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 挥发油的提取

采集水杉成熟种子，粉碎，用水蒸气蒸馏法提取2 h，分离水油混合物，无水硫酸钠干燥，得到浅黄色有浓郁香气的挥发油。将挥发油用乙醚稀释10倍，备用。

1.2.2 挥发油化学成分测定仪器及条件

采用气质联用仪（GC-MS）测定。型号，Agilent6850/5975 GC/MSD；检索图谱库，NIST05谱库。色谱条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm），载气为色谱纯氦气，流量1.0 mL/min，进样量1.0 μL，分流比20∶1，程序升温，设定柱初温为60 ℃，保持2 min后，以10 ℃/min升至230℃，运行6 min。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围29～350 amu，四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，EM电压1 400 V。

1.2.3 建立气相气质联用指纹图谱的方法

参照宋兴良等[14]、杨滨等[15]的研究结果，制定本研究方法。由于本检测仪器与“《药典》指纹图谱”软件和“浙江大学指纹图谱”软件不兼容，故参照沈阳药科大学指纹图谱体系，采用EXCEL计算相似度。

2 结果与分析

2.1 水杉种子挥发油成分分析

用毛细管气相色谱质谱联用技术对水杉种子挥发油的化学成分进行分析，利用色谱峰面积归一法测得各组分的相对含量，经NIST05质谱数据库检索，并与标准图谱核对，确定其成分。

2.2 记录时间的确定

取供试品溶液，精密吸取1.0 μL进样，记录色谱时间2 h。发现20 min后无吸收峰出现，故记录时间确定为20 min。

2.3 水杉种子挥发油 GC/MS图谱的重复性和重现性考察

重现性试验：取同批水杉种子挥发油，分别在0、8、24、48 h内，精密吸取1.0 μL进样，考察指纹图谱中规定色谱峰的绝对保留时问、相对保留时间、面积百分比的一致性，试验结果表明，叠加的色谱图峰位基本重合，样品在48 h内稳定（见图1）。

重复性试验：取同批次水杉种子挥发油，精密吸取1.0 μL进样，进行色谱条件测定，平行操作5次。试验结果表明，5次测定结果稳定，各共有峰的相对保留时间、峰面积比值及色谱相似度基本一致，表明方法重复性良好（见图2）。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 指纹图谱的制备

将10批次水杉种子挥发油，精密吸取各供试品溶液1.0 μL，分别进行色谱条件测定，记录20 min内的气相色谱质谱图。10批次水杉种子挥发油离子图具有较高的一致性（见图3）。

2.4.2 共有峰的确定

对10批次测定的GC/MS总离子流图进行对比，筛选出8个强度较大的共有峰，其中以α-蒎烯的色谱峰积分百分比最大且最稳定，因此选择为参照物峰，其标号为S，其余共有峰的标号依次为 1（s）、2、3、4、5、6、7、8（见图4）。

图2 水杉种子挥发油的重复性Fig. 2 Repeatability of volatiles in seeds of M. glyptostroboides

图3 10批水杉种子挥发油离子图比较Fig. 3 Comparison of volatiles ion in seeds of 10 batches M. glyptostroboides

图4 水杉种子挥发油的指纹图谱Fig. 4 Fingerprint of volatiles in seeds of M. glyptostroboides

2.4.3 保留时间和相对峰面积的计算

以α-蒎烯为参照物，计算各共有色谱峰的相对保留时间（见表1）和峰面积百分含量（见表2）。由表1得知各峰的相对保留时间基本一致（RSD＜0.5%），由表2得知，8个特征峰平均面积总百分含量为(87.710±4.861)%。

2.4.4 指纹图谱的确定

以8个共有峰建立指纹图谱（见图4）。根据表2确定各组分的相对百分含量。其中1号峰 为 α-蒎 烯（36.294±4.861）%，2号 峰 为 莰烯（2.995±0.161）%，3号峰为(1S)-6,6-二甲基-2-亚甲基-二环[3.1.1]庚烷（3.302±0.627）%，4号峰为β-蒎烯（3.377±0.597）%，5号峰为柠 檬 烯（16.680±0.356）%，6号 峰 为 (1S-内型)-1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-醇乙酸酯(6.459±3.202）%，7号峰为石竹烯（10.510±1.352），8号峰为石竹烯氧化物（8.096±2.235）%。

表1 各共有峰的相保留时间Table 1 Relative retention time of each common peak

表2 各共有峰的峰面积百分含量Table 2 Peak area percentage of each common peak

2.4.5 指纹图谱相似度评价

采用EXCEL表格计算10批次样品的各个离子峰相似度（见表3），其中以信阳产8批次为标准样品，结果发现10批样品相关系数≥94%，相似度≥90%，夹角余弦≥95%，相似性比≥0.89%，与分析的结果一致。其中1～8号样品呈高度相似性（≥98%），和9号、10号样品有一定差异性。

表3 10批水杉种子挥发油相似度比较Table 3 Comparison of similarity in seeds of 10 batches M. glyptostroboides

3 结 论

水杉种子作为一种新的活性成分资源，到目前为止，相关研究不多，尚未见到关于其质量控制方面的报道。挥发油作为水杉种子的主要活性成份之一，不同产地的产品，其含量和成分都存在一定的差异。通过建立气质联用指纹图谱，可以全面地反映出所含成分的相对关系，较好地反映出不同产地产品的差异性和相关性，判断产品质量的优劣。

本研究所分析的10个样品，含有8个主要特征成分，8个共有峰百分含量为(87.710±4.861)%，能够体现出本品的主要特征，各峰的相对保留时间和百分含量可作为本品的鉴别特征。其中 (1S-内型)-1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-醇乙酸酯、石竹烯含量差异很大，可能跟水杉生长环境有关。

本研究所建立的GC/MS色谱条件可使水杉种子挥发油中各组分达到较好的分离效果，重现性、稳定性良好，制定水杉种子挥发油指纹图谱具有较好的特征性，相关系数、相似度、夹角余弦、相似度均比较高，能够体现出地区差异性，可作为水杉种子专属性的指纹图谱。

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Establishment of GC/MS fi ngerprint of volatile oil of seeds ofMetasequoia

YANG Jun-jiea,b, WANG Hai-yana,b, MA Jun-yia,b
(a. Xinyang Engineering Research Center for Exploitation of Chinese Medicine Resources; b. Xinyang Key Laboratory of Detection and Analysis of Chinese Medicine,Xinyang College of Agriculture and Forestry, Xinyang 464000, Henan, China)

The volatile oil was extracted by water stream distillation method from 10 batches ofMetasequoia glyptostroboidesseeds,analyzed by GC/MS, the GC/MS fingerprint was established. The results show that there were 8 common characteristic peaks，the relative retention time of each peak was consistent (RRSD ＜ 0.5%)，the correlation coefficient (≥ 94%), similarity (≥90%), included angle cosine (≥ 95%), similarity ratio (≥0.89) all reached good level. This established GC/MS fi ngerprint had better characteristics, ref l ected the differences of origin, and can be used for the identif i cation of the seeds ofM. glyptostroboides.

seeds ofMetasequoia glyptostroboides; volatiles oil; fi ngerprints; GC-MS

S759.95

A

1673-923X(2014)09-0112-05

2013-11-10

河南省重大科技攻关计划项目（102102110119）；信阳农业高等专科学校青年教师科研基金（2009ZRKX013）

杨俊杰（1979-），男，河南南阳人，讲师，硕士，从事天然药物活性成份开发研究

马俊义（1960-），男，河南固始人，教授，硕士，从事化学生物活性成分研究与开发

[本文编校：谢荣秀]