离子色谱法测定盐酸法舒地尔中高哌嗪含量*

2013-12-29张锦梅王珊珊杨兰玲

化学分析计量 2013年5期

张锦梅，王珊珊，杨兰玲

（青岛盛瀚色谱技术有限公司，山东青岛 266101）

盐酸法舒地尔（fasudil hydrochloride），化学名称为六氢-1-(5-磺酰基异喹啉)-1(H)-1，4-二氮杂卓盐酸盐，是一种肌球蛋白轻链磷酸化酶、RHO 激酶抑制剂和新型细胞内钙离子抗结剂，该药能改善脑组织微循环，保护缺血脑组织，促进神经再生。高哌嗪是盐酸法舒地尔合成工艺中用到的一种原料［1］，通常要求其相对于盐酸法舒地尔的残留量不得超过0.1%。已有文献报道采用液相色谱法［2–3］、紫外分光光度法［4］检测盐酸法舒地尔中法舒地尔含量及气相色谱法［5］测定盐酸法舒地尔中残留溶剂的含量。而至今未见关于离子色谱法检测盐酸法舒地尔及原料高哌嗪的报道。笔者建立了非抑制电导阳离子色谱法测定盐酸法舒地尔原料药中高哌嗪的含量，方法准确度高、精密度好、简便易行，可用于盐酸法舒地尔生产过程中的质量控制。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪：CIC–300 型，内置柱温箱，青岛盛瀚色谱技术有限公司；

优普超纯水机：UPL–II 型，成都优普纯水仪有限公司；

电子天平：AL 104 型，瑞士梅特勒–托利多仪器有限公司；

甲烷磺酸：分析纯，国药集团药业有限公司；

乙腈：色谱纯，德国Merk 公司；

高哌嗪对照品、盐酸法舒地尔：某制药厂提供；

实验用水均为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 色谱条件

色谱柱：SH–CC–3 柱（100 mm×4.6 mm）；淋洗液：5.0 mmol／L 甲烷磺酸– 乙腈（体积比90∶10），流速为0.7 mL／min；柱温：30 ℃；直接电导检测；进样量：100 μL。

1.3 溶液配制

高哌嗪对照品溶液：1 mg／mL，精密称取高哌嗪对照品适量，用超纯水溶解并稀释而成；

系统适用性试验溶液：准确称取盐酸法舒地尔和高哌嗪对照品适量，用超纯水溶解并稀释制成盐酸法舒地尔质量浓度为3 mg／mL、高哌嗪质量浓度为3 μg／mL 的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；

供试品溶液：取盐酸法舒地尔约0.5 g，精密称定，置于25 mL 量瓶中，加超纯水溶解并稀释至标线，摇匀，作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 淋洗液的选择

高哌嗪的测定参照离子色谱测试方法（中国药典2010 年版二部附录VJ［6］）规定。根据法舒地尔及高哌嗪的化学结构选择以羧酸基键合硅胶基质作为填料的离子色谱柱。分别研究了浓度为2.5，5.0，7.5 mmol／L 甲烷磺酸淋洗条件下系统适用性试验中高哌嗪和法舒地尔的出峰及分离情况。试验发现即使甲烷磺酸浓度高达7.5 mmol／L 时，60 min 内只有高哌嗪能够出峰，法舒地尔不出峰，且高哌嗪峰与系统峰分离效果不佳。因此考虑选取在中间浓度5 mmol／L 甲烷磺酸淋洗液中加入一定量的有机溶剂（如乙腈）来缩短法舒地尔出峰时间。由于此款色谱柱所容许耐受的有机溶剂的最高使用极限为15%（体积分数），故选择乙腈的体积分数为5%，10%，15%进行对比试验。结果表明，当乙腈体积分数为5%时，分析时间太长无法满足要求；当乙腈体积分数为10%，15%时，分析时间可以满足要求。考虑到色谱柱使用过程中长期处于有机溶剂最大耐受极限可能会缩短色谱柱的使用寿命，甚至造成不可逆转的损伤，故最终选择5 mmol／L 甲烷磺酸添加10%乙腈作为淋洗液，既可以满足实验需要又能保证在合适的条件下使用色谱柱。

2.2 淋洗液流速的选择

除淋洗液组成外，淋洗液流速也是影响分离度和色谱峰形的关键因素之一。实验考察了淋洗液流速分别为0.5，0.7，0.9 mL／min 时对分离效果的影响。结果表明，低流速下分析时间长，色谱峰形不好；而较高流速下，柱子长时间在高压状态下工作容易造成柱子损伤；当流速为0.7 mL／min 时柱压适宜且分离效果良好、峰形理想，满足实验要求。

2.3 系统适用性试验

按照1.2 色谱条件及进样方法，做系统适用性试验，色谱图见图1。图1 色谱图中，高哌嗪和法舒地尔的分离度为6.6，理论塔板数按高哌嗪峰计算大于1 000。

图1 系统适用性试验溶液色谱图

2.4 工作曲线方程

精密吸取高哌嗪对照品溶液，逐级稀释后配制成质量浓度分别为2.0，4.0，8.0，10.0，20.0 μg／mL的系列标准溶液，在1.2 色谱条件下测定。以色谱峰面积Y对高哌嗪质量浓度X进行线性回归，得线性回归方程为Y=2.0×107X–2 159.2，相关系数r=0.992 4。高哌嗪对照品溶液色谱图见图2。

图2 高哌嗪对照品溶液色谱图

2.5 检出限与定量限

稀释高哌嗪对照品溶液并进样分析，至高哌嗪色谱峰近基线波动，重复进样3 次。当S／N=3∶1时，计算高哌嗪的检出限为0.049 4 μg／mL；当S／N=10∶1 时，计算高哌嗪的定量限为0.151 μg／mL。

2.6 精密度试验

取对照品溶液，在1.2 色谱条件下连续进样6 次，高哌嗪峰面积测定结果的相对标准偏差为0.47%，结果见表1。

表1 精密度试验结果

2.7 空白样品测定

对6 份空白盐酸法舒地尔样品溶液进样分析，结果显示，样品溶液中未检出高哌嗪残留，见图3。

图3 空白供试品溶液色谱图

2.8 回收试验

在3 mg／mL 空白盐酸法舒地尔溶液中加入2.4，3.0，3.6 μg／mL 3 个水平的高哌嗪溶液进行加标回收试验，结果见表2。由表2 可知加标回收率为97.6%～98.7%。

2.9 耐用性试验

在1.2 色谱条件下，分别控制淋洗液流速（0.7mL／min）变化±0.14 mL／min、柱温（30℃）变化±5℃、甲烷磺酸浓度（5.0 mmol／L）变化±2.5 mmol／L、乙腈体积分数（10%）变化±5%时，计算对照品溶液色谱峰面积结果的相对标准偏差，结果见表3。由表3可知，在所选实验参数变化范围内，高哌嗪对照品峰面积的相对标准偏差小于0.5%，证明了所建立方法的可靠性。