马尾松优良家系优株ISSR遗传距离分析

王 茜 ，张冬林 ，杨模华 ，邵俊培 ，李志辉 ，洪永辉

(1.林业生物技术湖南重点实验室，湖南长沙410004；2.中南林业科技大学 林学院，湖南长沙410004；3. University of Georgia, USA GA 30602；4. 福建省漳平五一国有林场，福建漳平364400；5. 福建省龙岩市马尾松研究中心，福建漳平 364400)

马尾松优良家系优株ISSR遗传距离分析

王 茜1,2，张冬林3，杨模华1,2，邵俊培1，李志辉1，洪永辉4,5

(1.林业生物技术湖南重点实验室，湖南长沙410004；2.中南林业科技大学 林学院，湖南长沙410004；3. University of Georgia, USA GA 30602；4. 福建省漳平五一国有林场，福建漳平364400；5. 福建省龙岩市马尾松研究中心，福建漳平 364400)

采用ΙSSR分子标记对福建漳平五一林场28个马尾松优良家系最优单株进行遗传分析，计算两两之间的遗传距离，进行遗传结构分析，结果表明：10条多态性引物共检测到99个位点（从250～2 300 bp），其中93个多态位点，多态位点百分率(P)为93.94%；28个马尾松无性系两两之间的分子遗传距离在0.212 1 ～0.565 6之间，遗传距离大于0.5的无性系对有11组，遗传距离小于0.25的无性系对有6组；在聚类分析自检举值为48处，可将28份马尾松无性系分为9类，其中7个无性系单独聚类，其他21个无性系聚成2类；遗传距离较大的无性系组分别出现在不同的聚类中，表明这些无性系组两两之间具有相对较远的亲缘关系。本研究为马尾松高世代育种群体的选育提供分子水平上的依据，为分子标记指导马尾松育种奠定了一定的研究基础。

马尾松；ΙSSR；遗传距离；杂种优势

马尾松Pinus massoniana Lamb 为松科松属常绿高大乔木，是我国南方松属中分布范围最广、人工造林面积最大的重要用材树种，经济价值高，可供工农业生产中的建筑、枕木、矿柱、制板、包装箱、胶合板、制浆造纸等使用。马尾松的遗传改良已经进入高世代种子园营建阶段[1]。由种子园选育，经子代测定而选出的优良个体，用于高世代种子园营建过程中，有必要了解育种群体种质个体之间的遗传背景和亲缘关系，这样在选择家系最优株作为高世代育种群体组成时，还需要考虑杂交亲本间尽可能具有较高杂种优势的可能，才能获得理想的种子园育种遗传增益。当前，在遗传和生理生化水平上，对亲本间潜在杂种优势进行预测的方法主要有配合力法[2]、遗传距离法[3-4]、叶绿体互补法[5]、同工酶法[6]、DNA 分子标记差异法[7]等。基于PCR的分子标记技术被广泛应用于林木遗传育种[8]等领域， DNA分子标记遗传距离法已被应用于植物杂种优势的预测中。如黄光文等[9]利用ΙSSR分子标记对水稻9个品种的遗传距离与其不完全双列杂交F1代个体的生物量、颖花等性状进行相关性研究，结果表明，遗传距离与生物学产量的中亲优势具有极显著的正相关，颖花和株高的中亲优势相关性也很显著。张一等[10]对马尾松双列杂交亲本遗传距离与杂种生长优势进行了相关性分析，结果表明，随着亲本间遗传距离的增大，子代生长性状的杂种优势呈线性增加，因此，应用遗传距离分析手段进行杂种优势预测具有一定的科学性。

试验对福建漳平五一林场的28个马尾松家系优选单株进行ΙSSR分子标记分析，计算两两优株之间的遗传距离，并通过PAUP4.0，PopGene32和NTSYS-PC软件对其进行遗传结构和遗传聚类分析，预测具有较高杂种优势，能用于高世代育种群体构建的优株亲本组合，为福建漳平五一林场马尾松高世代育种群体的选育提供分子水平的选择依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验材料采自福建漳平五一林场马尾松家系实验林，28个优良单株为洪永辉等[11]报道的经过子代测定，综合分析后优选出来的优良家系最优单株。2011年3月底采集幼嫩针叶，硅胶干燥带回实验室保存备用，28个优良的单株（无性系源株）产地来源见表1。

表1 28个马尾松家系优株样品来源Table 1 The 28 elite clones of masson pine (Pinus massoniana Lamb.)

1.2 总 DNA 的提取

采用改良的CTAB法提取基因组总DNA，经0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，根据标准Marker条带与DNA条带亮度的比对，确定不同样本的DNA浓度，最后稀释至15ng/µL左右保存备用。

1.3 ΙSSR-PCR 扩增

扩增反应在美国ABΙ公司的9700型PCR仪上进行。PCR反应总体积为20 µL，其中包括1.5 µL 的 2.5 mmol/L dNTPs，0.75 µL 的 50 mmol/L的 MgCl2，2.0 µL 的 10×PCR buffer，0.6 µL 的primer，0.2 µL 5 U/µL 的 Taq DNA ploymerase，1µL 的 15 ng/µL 的 DNA 模板，经优化的 PCR 扩增程序是：94℃预变性5 min；38个循环，每个循环 94℃变性 30 s，56 ℃变性 45 s，72 ℃延伸 2 min；72℃延伸7 min，4℃保存。PCR扩增产物在1.4%的琼脂糖凝胶（含0.1 mg/mL溴化乙锭）中电泳1.5 h，电泳液为0.5×TBE，将电泳分离的条带在Bio-Rad凝胶成像分析系统中拍照保存。

1.4 数据统计与分析

在Quantity One凝胶成像分析软件的帮助下，对分析样品的扩增条带进行记录，有扩增条带赋值为“1”，无扩增条带赋值为“0”，形成“0/1”数据矩阵图。利用PAUP4.0、PopGene32和NTSYS－PC三种群体遗传结构分析软件对28个马尾松优株无性系的ΙSSR数据进行遗传分析。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及 PCR 扩增结果

本实验先用3个马尾松DNA样品为模板，对100条ΙSSR引物（哥伦比亚大学提供的序列）进行PCR扩增，从中筛选出稳定性强，重复性好，多态性丰富的引物10条（见表2），用于28个马尾松样品的PCR扩增，图1为ΙSSR引物836在部分样本中扩增后的电泳图。10条ΙSSR多态性引物在所有无性系中共检测到99个位点，位点大小位于 250 bp～ 2 300 bp之间，其中有 93个多态位点，多态位点百分率（P)为93.94%，每条引物的扩增条带频率平均值位于0.43～0.71之间（表2）。不同的引物在28个样品中所检测到的位点数在7～14之间，引物826检测到的位点最多（14），引物834检测到的位点数最少（7），每条引物平均检测到9.3个多态位点。在所有的93个多态位点中，有4个多态位点的出现频率小于0.16，79个多态位点的出现频率大于0.16小于0.86，另有10个多态位点的出现频率大于0.86（图2）。

表2 筛选出的引物序列及其多态性Table 2 Sequences and polymorphism of ISSR primer

图1 引物836在马尾松部分样本中的ΙSSR电泳图Fig.1 Electrophoretic analysis of masson pine samples by primer 836

图2 93 个多态位点的频率分布Fig.2 Frequency distributions of 93 polymorphic alleles

2.2 遗传距离分析

利用PAUP4.0遗传分析软件对28个马尾松优株无性系DNA的ΙSSR扩增结果进行遗传距离分析，得到两两之间的遗传距离。样品间的遗传距离在一定程度上能说明它们亲缘关系的远近。从遗传距离表中发现，28个无性系两两之间的遗传距离在0.2121～0.5656之间，遗传距离最大的是181和195，两无性系之间遗传距离最小的是568和657；在所有的两两比较中，遗传距离大于0.5的分别为：181与（195、34、127、666），519与（346、34），603与（666、392、655、6），392与194这11组无性系对。遗传距离小于0.25的分别为：195与386，568与657，347与34，347与567，392与6，127与592这6对。

2.3 聚类分析

利用PAUP4.0对28个马尾松家系优株样本进行群体遗传结构聚类分析，采用邻接聚类法（NJ）得到聚类图（见图3）。由图3看出,在自检举值48的虚线处，有7个无性系如519、728、486、386、615、655、181分别各自单独聚类，说明这7个无性系各自与其它无性系之间的亲缘关系较远，另外的21个无性系则分别聚为2大类，其中无性系332、603、30、85这四个无性系逐级聚类，说明它们之间的亲缘关系很近，同样，194、62、592这三个无性系，6、392、127这三个无性系，也逐级聚类，表明它们的亲缘关系也非常近。对于这些亲缘关系表现特别近的无性系组，在今后的杂交育种中，建设不宜进行组内杂交亲本选择，而应尽量选择位于不同分类群中的无性系作为亲本，以利用子代杂种优势获得较高的遗传增益。

图3 28 个马尾松家系优株 PAUP 4.0 邻接（NJ）聚类图Fig. 3 Dendrogram among 28 elite clones of Pinus massoniana Lamb based on the genetic distances generated by PAUP 4.0

从产地种源来看，28个优良家系优株样品中，有17个来自五一林场马尾松种子园， 11个来自西陂林场马尾松种子园，而在28个优株无性系的聚类图上，两个种子园的样品并没有分别聚类，而是相互混合分散在各个聚类群中。这与两个种子园在建园时，部分亲本采用了同一无性系嫁接，因而部分亲本基因型相同，这导致了来自不同种子园的家系子代，其亲缘关系也还比较近，因此，当从表型方面选择高世代育种材料时，既要考虑家系子代来源，也还要考虑它们之间实际的亲缘关系，避免因近亲繁殖而降低高世代种子园亲本材料的遗传多样性水平。

2.4 遗传多样性分析

利用POPGENE32群体分析软件对五一和西陂两个种子园区的28个无性系进行群体遗传多样性分析（见表4），结果表明：五一林场种子园的总多态位点数为96，总多态位点百分比为96.97%，总 Shannon 信息指数 (I)为 0.564 3，总Nei’s基因多样性（h）为 0.386 3，与张冬林等[11]对湖南城步种子园遗传多样性的研究结果相比略高（Shannon信息指数和Nei’s基因多样性分别为0.503 0，0.334 7）。表明本马尾松家系优株群体具有较高的遗传多样性水平。其总群体基因多样性（Ht）为0.3860，群体内基因多样性（Hs）为0.374 8，群体间基因分化系数为0.028 9，来自两个种子园家系优株群体间的遗传变异约为2.89%，而存在于种子园家系优株群体内的变异量高达97.11%，这与李志辉等[12-13]对马尾松群体遗传多样性结构分析的研究结果一致，即马尾松群体内存在着非常丰富的遗传变异，基因多样性水平高，群体间遗传分化较小。张薇等[14]对福建马尾松实生种子园自由授粉子代群体的研究结果表明，自由授粉子代群体的Shannon多样性指数为1.034，Nei多样度为0.574 0，这些多样性测度指标明显高于本研究中相关指标的赋值水平。我们对采样策略进行的比较，发现，张薇等所取样的实验材料为马尾松完全自由授粉子代实生苗群体[14]，而我们取样的实验材料为经12年子代测定试验后获得的优良家系最优单株[11]，采样策略不同，对种子园子代群体的选择强度不一样。因此，在高强度选择取样策略下，本论文中的Shannon多样性指数以及Nei’s基因多样性水平值与张薇等[13]研究结果比较，明显的偏低。这样的研究结果也为育种世代与育种群体的遗传多样性水平的负相关关系进一步提供了佐证，符合群体遗传多样性水平发展的一般规律，即随着种子园育种世代的提高，其选择强度增加，与此同时育种群体的遗传多样性水平确会有一定程度的下降。

表3 马尾松群体遗传多样性分析Table 3 Genetic analysis of Pinus massoniana Lamb.

2.5 马尾松家系优株间 NTSYS-PCA 主成分分析

利用NTSYS-PC软件对28个马尾松家系优株进行主成分分析，计算Jaccard系数相似性矩阵，进行PCA主成分分析（见图4）。28个无性系聚类结果与PAUP 4.0结果相似。在PCA聚类图示的密集和分散度的模式中，对于密集区域的样本，其遗传一致度高，在种质筛选时应综合考虑，选择其一便可；而对那些分散分布的无性系，说明其种质特异性较高，可作为高世代亲本选择时的重点选择对象。由此，我们可对分布密集区的样本进行筛选，而对分散区的样本予以保留，特别是那些处于外围的样本，如34、592、519、603和181这五个无性系可作为重点选择对象。

3 结论与讨论

图4 28 个家系优株的 NTSYS-PC 主成分分析Fig.4 Principal component analysis by NTSYS-PC software for 28 clones

亲本遗传距离与杂交优势的相关性研究为选择育种提供了一定的理论依据[15]。对马尾松双列杂交亲本遗传距离与杂种生长优势的相关性分析结果表明，随着亲本间遗传距离的增大，子代生长性状的杂种优势呈线性增加[10]，因此，在选择杂交育种亲本时，一方面考虑表型优株，同时也考虑选择遗传距离较大的亲本对，可在一定程度上提高子代杂种优势水平，从而获得胸径、材积等表型性状优良的子代，以获得更高的种子园育种遗传增益。

本试验对马尾松28个家系优株进行遗传距离聚类及遗传关系分析，并以此可作为高世代杂交育种亲本选择时的部分依据，结果表明：

1）根据PAUP4.0聚类分析结果，作为育种群体的亲本，应尽量选择遗传距离大于0.5的组合：181和（195、34、127、666），519和（346、34），603和（666、392、655、6），392和 194这11对无性系；而应尽量避免遗传距离小于0.25的无性系对。根据NTSYS-PC软件分析结果，可重点选择34、592、519、603和181这五个无性系作为育种亲本进行杂交育种，子代获取较高杂种优势的可能性更大，并能产生较高的种子园育种遗传增益。

2）对这28个最优家系的最优单株进行PAUP 4.0聚类分析表明：在自检举值为48处，7个无性系样品单独各自聚类，而其他21个无性系样品分别聚为2类。除了无性系368与194外，其余10组遗传距离大于0.5的无性系对，成对两个无性系均分别出现在不同的聚类群中。这说明，采用分子标记对育种群体进行分子遗传结构分析，能一定程度地阐明育种群体的遗传背景，揭示其亲缘关系的远近，从而可为指导马尾松高世代种子园营建提供分子水平的理论依据。

3）从各家系优株无性系的产地来源来看，尽管地理距离在一定程度上决定了群体间的遗传距离及遗传多样性水平，但随着种子园育种改良世代的增加，这种地理距离的决定关系会因种子园世代的提高而减弱；尤其是随着选择强度的增加，育种群体的遗传多样性水平会有一定程度的下降。因此，为有预见性地拓宽高世代种子园育种亲本的遗传多样性水平，应适当增加上一世代育种繁育系统之外的优良亲本，并可借助分子标记技术手段对进入高世代育种群体的样本进行遗传多样性水平和亲缘关系检测，以提高杂种优势预测水平。

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ISSR analysis of genetic distance of Pinus massoniana Lamb. Elite clones

WANG Qian1,2, ZHANG Dong-lin3, YANG Mo-hua1,2, SHAO Jun-pei1, LΙ Zhi-hui1, HONG Yong-hui4,5
(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 3. University of Georgia, USA GA 30602; 4.Wuyi National Forest Farm Fujian Province, Zhangping 364400, Fujian, China; 5. Mason Pine Research Center of Longyan Fujian Province, Zhangping 364400, Fujian, China)

ΙSSR (Ιntro-simple Sequence Repeat) were employed to study the genetic analysis and GD ( genetic distance) among 28 elite clones in Pinus massoniana Lamb. The results indicated that 10 polymorphism markers totally produced 99 alleles (size ranged from 250 to 2300bp) and 93 were polymorphic, the percentage of polymorphic alleles (P) was 93.94%. The GD among 28 clones ranged from 0.2121 to 0.5656. There were 11 pairs of clones’ GD larger than 0.5 and 6 pairs of clones’ GD less than 0.25; The 28 clones were clustered into nine groups at the value of 48, of which seven clones were clustered separately and the other 21 clones were clustered into two groups; Those pairs of clones with larger GD appeared in different groups which showed a distant relationship with each other. These f i ndings provided some insight into the selection of elite clones in breeding population on advanced generation orchard and it would guide the breeding work of Pinus massoniana Lamb more eff i ciently at the molecular level.

Pinus massoniana Lamb; ΙSSR marker; genetic distance; hybrid vigour

S791.248

A

1673-923X(2013)12-0072-05

2013-04-01

湖南省教育厅优秀青年基金项目资助（09B112）

王 茜（1988-），女，山西运城人，硕士研究生，从事林木定向育种理论与技术研究

杨模华（1974-），博士，副教授，主要从事森林培育教学和科研；E-mail：ymh163@163.com

[本文编校：吴 彬 ]