伯乐树cpDNA-PCR反应体系的优化与引物筛选

胡尚力，徐刚标，梁 艳，刘雄盛，肖玉菲，郝博搏

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004）

伯乐树cpDNA-PCR反应体系的优化与引物筛选

胡尚力，徐刚标，梁 艳，刘雄盛，肖玉菲，郝博搏

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004）

伯乐树为国家一级保护植物，在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面具有重要的科学价值。cpDNA-PCR反应是在分子水平上确定伯乐树系统分类的基础。建立了伯乐树cpDNA-PCR反应体系，对影响扩增反应的因素（Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度以及模板DNA浓度）进行了优化，得到了伯乐树cpDNAPCR扩增反应的最佳体系，并筛选出了适合伯乐树分子谱系地理研究的非编码区序列和引物。伯乐树cpDNAPCR最佳反应体系为：30 μL反应体系含有10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11 μmol、DNA模版30 ng以及3个单位的Taq酶。适合于伯乐树分子谱系地理学研究的3对引物及其退火温度为PipetB1411F-PipetD738R(52℃ )、psbA-trnHGUG(59℃ )、trnL-trnF(56℃ )。

伯乐树；cpDNA；PCR体系优化；引物筛选

伯乐树Bretschneidera sinensis Hemsl.为伯乐树科伯乐树属，因其花萼似钟状，故又名钟萼树，零散分布于浙江、台湾、福建、湖南、湖北、广东、广西和四川等省（区），是我国特有的单型科植物，已被列为国家一级保护植物[1]，在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面具有重要的科学价值。

目前对于伯乐树遗传多样性[2-3]、生物学特征、生态学特性、系统发育、种群遗传及繁殖技术等方面已进行了大量的研究工作[4]，但伯乐树系统地位仍存在争议[5]。叶绿研究（chloroplastc DNA，cpDNA）分子标记技术已广泛应用于植物系统分类、系统发育以及种群遗传结构等方面[6-8]。cpDNA分子标记的基础是PCR反应，受多种影响因素。PCR技术目前在诊断遗传病、克隆基因、植物育种等方面均有应用[9-13]。本研究通过优化伯乐树cpDNA-PCR反应体系，筛选出适合于系统分类研究的非编码区序列引物，为在分子水平上确定伯乐树系统分类地位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

优化cpDNA-PCR体系的12株伯乐树标本于2012年7～10月采自广西猫儿山自然保护区。取其新鲜叶片用硅胶干燥后，带回实验室储存于-70℃冰箱中备用。

cpDNA非编码序列标记引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供（见表1），Taq DNA Ploymerase、dNTPs、Mg2+、10×Buffer、Marker DGL1500、Maker DGL2000购置于天根生化科技有限公司。

表1 实验所用引物序列Table 1 Primer sequences used in analysis

1.2 基因组DNA提取与检测

采用改良的CTAB法提取伯乐树总DNA，用0.8%琼脂糖凝胶对基因组DNA质量进行电泳检测，DNA浓度和纯度采用Eppendorf公司的Biophotometer核酸蛋白分析仪进行测定，并将DNA浓度稀释为20 ng/μL。

1.3 PCR反应及产物检测

[14]，首先确定基本扩增反应体系 (30 μL) 为：3 μL 10×PCR buffer、2.5 mmol Mg2+、100 mmol dNTP、上下游引物各 10 μmol、DNA模版25 ng以及3个单位的Taq酶。

PCR反应程序为：94℃预变性 4 min，35个循环；95℃50 s，退火50 s，72℃5 min；最后以72℃延伸10 min。设计反应条件中的4种不同因素（Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度以及模板DNA浓度）进行梯度实验。浓度梯度见表2。

表2 cpDNA-PCR反应系统浓度设计Table 2 Concentration grads for cpDNA-PCR reaction system

扩增产物的检测：取2 μL 上样缓冲液与5 μL扩增产物混合后在浓度为1.6%的琼脂糖上进行电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电压5 V/cm。在SYNGENE凝胶成像系统上记录结果。

1.4 引物筛选

对 rpl16、trnK、rps16、petD内 含 子，trnS-trnG、trnT-trnF、atpB-rbcL、psbA-psbH 、trnL-trnF、trnC–rpoB基因间隔区共9对引物进行筛选，得到适合cpDNA基因间隔区标记的引物。

2 结果与分析

2.1 伯乐树叶绿体基因组DNA的纯度与浓度

12株伯乐树标本提取的总DNA经核酸蛋白分析仪测定的纯度与浓度结果见表3。

表3 伯乐树叶绿体基因组DNA的纯度与浓度Table 3 The concentration and purity of total DNA

OD260nm/OD280nm比值是衡量总DNA纯度的指标。若比值低于1.6，说明DNA中混有RNA杂质，若比值高于2.0则说明DNA中混有蛋白质杂质。由表3可知，比值在1.6～2.0之间，说明实验提取的总DNA含量较高，符合PCR反应所需的要求。

2.2 cpDNA非编码序列的PCR反应体系与反应程序

2.2.1 Mg2+浓度的确定

Mg2+是反应混合物中Taq酶的激活物，并且影响反应的效率[15]。4个Mg2+浓度梯度下扩增产物凝胶成像结果如图1所示。图1中Marker为D2000。

图1 不同Mg2+浓度下扩增产物凝胶电泳Fig.1 The gel electrophoresis image of different Mg2+concentrations

由图1可以看出，随着Mg2+浓度的升高，电泳条带由暗变亮，2.9 mmol时条带明亮且清晰。

2.2.2 dNTP浓度的确定

dNTP在生物DNA、RNA合成中以及PCR反应中起原料作用。在PCR反应中，dNTP的浓度会影响非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入[16]。本实验设置了4个梯度的dNTP浓度，扩增结果如图2所示。

图2 不同dNTP浓度下扩增产物凝胶电泳Fig. 2 The gel electrophoresis image of different dNTP concentrations

由图2可见，dNTP浓度在80～140 mmol时电泳条带均很明亮，而浓度为120 mmol时条带最为清晰。

2.2.3 引物浓度的确定

引物的作用是帮助游离的碱基结合到DNA单链上去，在一定范围内，引物浓度越大DNA复制越快，超过一定浓度，即达到饱和状态，对PCR影响减弱。如果引物浓度过高，还会因为引物与体系中的镁离子结合而影响酶的活性，并产生大量引物二聚体[17]。本实验设置了4个梯度的引物浓度，扩增结果如图3所示。

图3 不同引物浓度下扩增产物凝胶电泳Fig. 3 The gel electrophoresis image of different primers concentrations

从图3可以看出，当上下游引物浓度为10 mmol和12 mmol时，条带清晰但较暗；当浓度为9 mmol和11 mmol时条带清晰，但11 mmol浓度条带更为明亮。因此上下游引物最佳浓度为11 mmol。

2.2.4 DNA模版浓度的确定

DNA模版就是要扩增的DNA片段，同样在一定范围内，模版浓度越高DNA复制越快，但如果模版浓度过高会导致非特异性的扩增，并且在电泳检测时会导致条带弥散[18]。4种不同浓度的DNA模版扩增结果如图4所示。

从图4可知，当DNA模板为20 ng/μL时，条带较为暗；浓度达到25 ng/μL时，条带明显变亮。从扩增结果来看，DNA模板浓度在30 ng/μL时最好，条带最为清晰、明亮。

2.3 伯乐树cpDNA-PCR的最优反应体系

根据PCR各项反应因素优化结果，得到的伯乐树cpDNA-PCR最优反应体系（30 μL）为：10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11 μmol、DNA模版30 ng以及3个单位的Taq酶。

图4 不同DNA模版浓度下扩增产物凝胶Fig.4 The gel electrophoresis image of different template DNA concentrations

2.4 引物筛选

根据已优化的PCR反应体系和程序，对rpl16、trnK、petD 内 含 子，trnS-trnG、trnT-trnF、atpB-rbcL、psbA-psbH 、trnL-trnF、trnC–rpoB基因间隔区共9对引物进行筛选。实验中引物的退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模版DNA的序列长度[19]。而引物的退火温度会对引物与模版的特异性结合产生影响，因此对于不同引物的退火温度需要进行单独且细致的筛选。本试验中先以Tm值计算得出的理论退火温度为标准，进行梯度为2℃的6个退火温度的试验，得到初步的最适温度。再以这个温度为标准，设置梯度为0.5℃的6个退火温度，最终确定该引物的最佳退火温度。最终获得电泳条带清晰、明亮、单一的引物共3对，结果见表4。

表4 筛选出的4对引物Table 4 The four pairs of selected primers

利用3对最佳引物获得的PCR产物经1.6%凝胶电泳检测，结果见图5、图6、图7。

图5 petD内含子扩增产物凝胶电泳Fig.5 The gel electrophoresis image of petD intron amplif i cation result

图6 psbA-trnH基因间隔区扩增产物凝胶电泳Fig.6 The gel electrophoresis image of psbA-trnH intergenice spacer amplif i cation result

图7 trnL-trnF内含子扩增产物凝胶电泳Fig.7 The gel electrophoresis image of trnL-trnF intron amplif i cation result

3 结 论

cpDNA分子标记是基于PCR反应的技术，受到反应中多种因素的影响，所以应对各种因素进行优化以得到最佳的反应体系。对于实验结果的分析，是以凝胶电泳条带清晰程度、亮度以及单一性来判断的，具有一定主观性。因此应进行多次重复试验，去除主观因素的影响，得到稳定的结果。

实验得到伯乐树的最优cpDNA-PCR反应体系（30 μL） 为：10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11 μmol、DNA模版30 ng以及3个单位的Taq酶。通过优化后的体系筛选出适合于伯乐树分子谱系地理学研究的3对引物及其退火温度为：PipetB1411F-PipetD738R（52℃）、psbA-trnHGUG（59 ℃）、trnL-trnF（56 ℃）。

参考文献：

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[2] 梁 艳, 徐刚标, 张合平, 等. 南岭地区伯乐树自然和人工迁地保护种群的遗传多样性[J]. 林业科学, 2012, 48(12):45-52.

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[5] 刘成运. 伯乐树科及其近缘科的花粉形态研究[J]. 云南植物研究,1986,8(4):441-450.

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Optimization of cpDNA-PCR system for Bretschneidera sinensi and primers screening

HU Shang-li, XU Gang-biao, LIANG Yan, LIU Xiong-sheng, XIAO Yu-fei, HAO Bo-bo
(School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Bretschneidera sinensis is a kind of national first-grade protected plants and has important scientific value in studying angiosperm’s phylogeny, paleogeography and paleoclimate. The cpDNA-PCR reaction is the basis of determinting the phylogenetic classif i cation of B. sinensis at the molecular level. The concentrations of Mg2+, dNTPs, primers and template DNA affecting the cpDNAPCR that will affect the amplif i ed reaction were optimized to establish the cpDNA-PCR for B.sinensis, and the suitable non-coding sequences and primers for B. sinensis on molecular phylogeography were screened. The optimum 30 μL reaction system contained 10×PCR buffer, 2.9 mmol Mg2+, 120 mmol dNTPs, 11 μmol primers, 30 ng template DNA and 3 units Taq polymerase. The 3 pairs of primers that are appropriate for the geographical study of molecular genealogy of B. sinensis and their corresponding annealing temperatures were screened out as followings: PipetB1411F-PipetD738R (52℃ ), psbA-trnHGUG (59℃ ), trnL-trnF (56℃ ).

Bretschneidera sinensis Hemsl.; cpDNA; optimization of PCR system; primers screening

S794.9；Q78

A

1673-923X(2013)07-0067-05

2012-12-16

林业公益性行业科研专项经费项目(201104033)；湖南省研究生科研创新项目(CX2012B326)

胡尚力（1989-），男，湖南湘潭人，硕士研究生，主要从事生物化学与分子遗传学研究

徐刚标（1965-），男，安徽枞阳人，教授，博士，博士生导师，主要从事植物种群遗传与育种研究

[本文编校：谢荣秀]