人冠状病毒与人类呼吸道感染

沈 军 俞 蕙 朱启镕

·综述·

人冠状病毒与人类呼吸道感染

沈 军 俞 蕙 朱启镕

21世纪初10余年，新型及变异人类呼吸道病毒已多次威胁全球人类。2012年9月25日， WHO发布3天前在英国确诊的1例新型冠状病毒致命性感染病例，并认为该病例与不久前在沙特阿拉伯的1例新型冠状病毒致命性感染相关，新型人冠状病毒(HCoV)致命性感染人类再次发生[1]。随即这种新型HCoV的全基因序列在GenBank中被公布，新的冠状病毒被命名为HCoV-EMC/2012[2]。基于病毒upstream of the E gene (upE)和open reading frame (ORF)1b两个基因片段的实时PCR检测方法的文献于2012年9月27日在欧洲监测网络发表[3]。与所有已知的病毒核苷酸同源性比较，HCoV-EMC/2012同蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5同源性最高[4～7]。截至2013年3月23日，WHO共确认16例HCoV-EMC/2012感染病例(表1)，其中有9例死于重症肺炎(其中至少4例合并肾功能衰竭)[8,9]；HCoV-EMC/2012病毒分离于1例60岁死亡沙特阿拉伯男性痰液标本中[3～5]。最初10例确诊病例基于流行病学信息分为两组，分别来源于沙特阿拉伯、约旦和卡塔尔，提示这种病毒可能存在人与人之间传播；第11、12例患者在英国发病，发病前没有疫区的旅游史，但与从沙特阿拉伯旅游回英国的第10例属同一家庭成员，进一步提示HCoV-EMC/2012能够在人与人间传播，引起人们对HCoV-EMC/2012在人群中广泛流行的担忧[10～14]；第13例患者2013年1月在沙特阿拉伯发病并于同年2月死亡，在2013年2月分别又有2例沙特阿拉伯患者发病死亡，第16例沙特阿拉伯患者仅有轻微的呼吸道症状[8]，与2012年4月回溯性确认的HCoV-EMC/2012首次在人群中流行有间隔11个月之久[15]，提示HCoV-EMC/2012在人群中可能长期潜伏或流行，或者从动物源性的寄生宿主间歇性地传播到人群[6,7,9,16～19]。鉴于2002至2003年SARS的致命性短暂全球流行[20]，HCoV的变异与流行再次成为研究与讨论的热点。本文就HCoV致人类呼吸道感染及病毒基因变异和进化进行综述，并根据GenBank中已知的HCoV基因序列运用MEGA5.1软件进行核苷酸序列比对和进化树分析，以展现HCoV-EMC/2012与之前已知的5种HCoV的亲缘关系，为进一步了解HCoV与人类呼吸道感染的关系提供帮助。

注 例11和12无旅游史，提示在英国感染；肾衰：肾功能衰竭

1 6种HCoV

HCoV最早被发现是在20世纪60年代(HCoV-229E和HCoV-OC43)，是已知自然界中最长序列RNA病毒，其单股正链基因序列长达26～32 kb，能够引起人类和动物呼吸道、消化道和神经系统感染[21,22]。2002至2003年在全球致命性流行的人SARS冠状病毒(SARS-CoV)由于在人群中从未有流行，故人群普遍易感，感染后死亡率非常高，全球共确诊8 422例病例，死亡916例[23,24]。 2004年荷兰学者van der Hoek等[25]从1名7月龄的支气管炎儿童呼吸道标本中分离到另一种新的冠状病毒：HCoV-NL63 ；2005年Woo等[26]在香港从1名71岁老年人呼吸道中发现第5种HCoV ，即HCoV-HKU1；随后的血清学方法证明在3.5岁以下儿童中，大部分已感染过HCoV-229E和HCoV-NL63并产生抗体[27],，50岁以上人群4种HCoV血清学阳性率均在90%以上[28]，证实4种非SARS-HCoVs在人群中有长期普遍流行。4种非SARS-HCoVs临床多表现为亚临床感染或轻度呼吸道感染，但在儿童、老年人、免疫功能抑制等人群中可致重症呼吸道感染[29～31]。

根据基因的进化树分析，自然界的冠状病毒分为4组，人冠状病毒分属于其中的2组：HCoV-229E和HCoV-NL63属于α组，HCoV-OC43和HCoV-HKU1属于β组A亚组，而SARS-CoV属于β组B亚组，γ组和δ组的冠状病毒目前还是动物源性，如在牛、蝙蝠、果子狸、鸟类等中循环流行[32]。所有冠状病毒都有一个共同的基因组结构；其中复制酶基因包括了5′总基因组的2/3，是由两个重叠的开放阅读框(ORFs)即ORF1a和ORF1b组成；结构基因覆盖了3′总基因组的1/3，以规范的顺序编码结构蛋白质基因，即5′-spike(S)-envelope(E)-membrane(M)-nucleocapsid(N)-3′；β组的一些冠状病毒还在ORF1b和S基因之间携带额外的结构蛋白基因，编码血凝素酯酶。在基因进化树中，HCoV中只有HCoV-229E和HCoV-NL63有比较密切的联系；HCoV-OC43与牛、猪和马的冠状病毒紧密联系；人SARS冠状病毒来源于动物源性，与果子狸和蝙蝠的SARS冠状病毒非常近缘[32,33]。 根据对HCoV-EMC/2012全基因序列分析发现，其与蝙蝠的冠状病毒(BtCoV-HKU4和 BtCoV-HKU5)同属β组C亚组，为从未所知的新型HCoV，是第6种HCoV[5]。HCoV-EMC/2012与其他冠状病毒基于Spike基因序列的进化树分析见图1。

图1 HCoV-EMC/2012与其他冠状病毒进化树

注 HCoV-EMC/2012, human betacoronavirus 2c EMC/2012 (JX869059); HCoV-HKU1, human coronavirus HKU1 (NC_006577); Ty-BatCoV-HKU4, Tylonycteris bat coronavirus HKU4 (NC_009019); Pi-BatCoV-HKU5, Pipistrellus bat coronavirus HKU5 (NC_009020); SARS CoV, SARS-related human coronavirus(NC_004718); HCoV-OC43, human coronavirus OC43 (NC_005147); MHV, murine hepatitis virus(NC_001846); Ro-BatCoV-HKU9, Rousettus bat coronavirus HKU9 (NC_009021); SARSr-Rh-BatCoV HKU3, SARS-related Rhinolophus bat coronavirus HKU3 (DQ022305); BWCoV-SW1, beluga whale coronavirus SW1 (NC_010646); IBV-partridge, partridge coronavirus (AY646283); MunCoV HKU13, munia coronavirus HKU13 (FJ376622); CMCoV HKU21, common moorhen coronavirus HKU21 (NC_016996); ThCoV HKU12, thrush coronavirus HKU12 (FJ376621); HCoV-229E, human coronavirus 229E (NC_002645); HCoV-NL63, human coronavirus NL63 (NC_005831); PEDV, porcine epidemic diarrhoea virus (NC_003436); Sc-BatCoV 512, Scotophilus bat coronavirus 512 (NC_009657); Mi-BatCoV HKU8, Miniopterus bat coronavirus HKU8 (NC_010438); Mi-BatCoV 1A, Miniopterus bat coronavirus 1A (NC_010437), TCoV, turkey coronavirus (NC_010800)

2 HCoV的基因变异与进化

根据分子钟(Molecular clock)的计算分析，HCoV-229E和HCoV-NL63在1 000年前来源于一个共同的祖先[34]，HCoV-229E与蝙蝠GhanaBt-CoVGrp1在公元前1686至1800年有共同的祖先，人SARS-CoV与蝙蝠GhanaBt-CoVGrp2在2 400年前来源于同一株病毒[35]，而与果子狸SARS-CoV最近的共同祖先就在1999至2002年[36]。并且，所有的冠状病毒在公元前8100年有共同祖先；α、β、γ和δ组冠状病毒分别在公元前2400年、公元前3300年、公元前2800年和公元前3000年开始有不同的进化枝；蝙蝠与鸟类这些飞行的温血动物是冠状病毒理想的宿主，α、β组冠状病毒依托蝙蝠，γ和δ组冠状病毒依托鸟类加速进化和传播[32,37]。

从实验室到自然界研究都已经证实，所有的冠状病毒都有高度的基因变异率，在2种不同基因型的病毒株感染同一细胞时，病毒基因能够重组[32,38]。即意味着在理论上，目前全球流行的普通HCoV及只感染一些动物的冠状病毒，可能存在与SARS类似的情况，即病毒基因进行重组变异产生新的毒株，导致不可预见的流行宿主范围和致病性。目前为止已发现两种动物源性冠状病毒到人类传播的情况，即属于β组B亚组的SARS-CoV从蝙蝠到人类的传播[36,39]，以及属于β组A亚组的牛冠状病毒到HCoV-OC43在人类的传播[32,40]。而流行病毒株适应生存与持续传播，其基因也必然在持续的变异之中，有时即使单个核苷酸的变异也有可能导致病毒毒力的改变[41-45]；当病毒基因核苷酸存在较大的异质性时，甚至通过基因重组，出现新的基因型流行株[41,44,45]。冠状病毒具有高度基因突变率的主要原因有：①RNA依赖的RNA聚合酶基因(Pol)多变，自然变异率为每年每1/1 000～1/10 000核苷酸位点发生替换；②RNA依赖的RNA聚合酶高频率的同源性RNA重组；③冠状病毒基因组大，提供了其较其他病毒有额外的可塑性[32, 43]。由于冠状病毒多见与其他病毒混合感染(包括不同型/亚型的冠状病毒之间)，有利于同源性及异源性基因重组。最近的研究发现，牛冠状病毒在感染宿主过程中病毒基因能够发生变异和筛选以适应宿主环境并可能导致跨宿主感染发生[45]。这次新发现HCoV-EMC/2012全基因序列分析与蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5核苷酸同源性最高(β组C亚组)，与两者在ORF1ab的七段保守区域核苷酸同源性分别为75%和77%(均远离判断为同种病毒的90%核苷酸同源性标准)；HCoV-EMC/2012与SARS-CoV同属β组，但两者分属C和A亚基因组，两者之间同源性较低[5,6]。HCoV-EMC/2012是否从动物源性冠状病毒跨种族间感染，或者是既往流行病毒株发生基因变异或重组后形成新的病毒株导致人类致命性感染，目前尚未可知[5,6,9,16～19]。

3 宿主病毒受体与冠状病毒的传播

HCoV-EMC/2012的宿主细胞受体尚未完全明确，但已知这种新的病毒并未如SARS-CoV以人血管紧张素转化酶受体2(hACE2)作为感染宿主的受体。尤为重要的是，HCoV-EMC/2012能够感染蝙蝠、猪和人类细胞，提示这种病毒也许以3种物种共有的受体分子感染宿主细胞，暗示病毒能够在3种物种间跨物种传播[16]。如A型流感病毒H5N1进入细胞需要末端有α2，3唾液酸结构的多糖受体，而人类的A型流感病毒株需要α2，6唾液酸结构；末端有α2，3唾液酸结构的多糖受体在人类呼吸道很少且仅局限于下呼吸道，也就是这种病毒在人群中很难流行的原因。需要指出的是，牛冠状病毒和HCoV-OC43是以结合唾液酸受体侵入宿主细胞。目前仅有16例HCoV-EMC/2012确诊病例，人与人之间传播证据不足，提示病毒可能也以主要存在于人类下呼吸道的某种蛋白为受体感染人类[26,46]。这样的例子犹如SARS-CoV，由于hACE2大量存在于人体的肺部，而在上呼吸道很少，所以大部分SARS-CoV感染患者在发展为肺炎时才有传染性[47,48]。另外，与SARS-CoV主要引起肺炎不同，HCoV-EMC/2012感染多有肾功能衰竭，提示在人类肾脏也有病毒受体[17,46,49]。冠状病毒的Spike蛋白主要存在于病毒表面，决定了病毒的宿主范围和组织特异性，也是病毒的抗体中和位点[50,51]。对Spike蛋白结构与功能的研究，对寻找病毒受体及深入理解病毒致病机制、疫苗研究非常重要。有研究通过对SARS-CoV的Spike蛋白结构推算，认为HCoV-EMC/2012的Spike蛋白也同样可能是受体结合位点(RBD)及重要抗体中和位点(CND)[52]。新近的研究发现，HCoV-EMC/2012的Spike蛋白能被宿主细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)激活而融合宿主细胞，并且HCoV-EMC/2012感染宿主细胞的Spike蛋白受体确实与已知的冠状病毒受体(hACE2、CD13和CEACAM1)不同；在来源于不同组织(包括肺、肾和结肠)的人类细胞培养体系中，HCoV-EMC/2012都能感染细胞产生溶细胞作用，提示这种病毒可以有呼吸道以外的途径进行传播。更为重要的是，研究证实HCoV-EMC/2012的Spike蛋白如同其他的冠状病毒Spike蛋白一样，是主要的中和抗体的靶蛋白，能够被从1名病毒感染的患者血清分离到的Spike蛋白特异性中和抗体结合，使病毒失去感染细胞的能力[4,16,18,46]。

4 对冠状病毒在人群中流行的监测、预警和控制

从2003年SARS病毒的不同寻常的出现及随后史无前例的全球感染协作控制的成功，为高度警惕临床不明原因的致命性呼吸道感染病例个体事件的出现提供了依据。在HCoV-EMC/2012感染被确认后，2012年9月26日WHO即发布了全球新型冠状病毒预防和控制指南，随后发布了实验室检测技术指导、实验室生物危害管理技术指导、新型冠状病毒感染病例定义、感染流行监视指导和临床处理建议[53]。英国卫生防护局(HAP)也有相应的预防指南发布[54]。根据WHO指南，对集体性急性重症呼吸道感染(SARI)和其他异常感染及流行状况进行全球密切监测；建议对有不能解释病因的肺炎、重症进展性或对治疗无反应的呼吸道疾病患者要考虑HCoV-EMC/2012感染可能，尤其对有疫区旅游史的患者；对全球任何地方发生的卫生工作人员中发生的集体性SARI进行彻底的调查[8,55,56]。早在2012年4月，约旦发生了包括卫生工作人员在内的集体SARI事件[57]，在约旦卫生部长立即向WHO汇报后，WHO派遣美国海军第三医学研究处(NAMRU-3)的一队小组进行协助调查，但当时未能找到病原；在2012年9月HCoV-EMC/2012被发现后，约旦将冻存的在2012年4月患者采集的标本送NAMRU-3进行检测后，确认了2例HCoV-EMC/2012感染死亡病例，由此揭示这种病毒在2012年4月起即已经在人群中流行[58]。

通过对确诊16例患者之间流行病学研究及对其他接触人群进行暴露后10天内的病毒检测及随访监测，目前的信息认为HCoV-EMC/2012能在人群中的传播但传染性并不强[6,13,14,59-61]。由于目前仍未确定这种病毒是否在发生变异后从动物源性宿主跨物种传播到人群，尽管在核苷酸同源性及进化树分析上提示可能来源于蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5，病毒的储存宿主或者可能的中间宿主(如牛、果子狸等)仍未能确定。病毒在向人群中或在人群中的传播途径、病毒的接种时间与排毒时间、病毒学机制、在人类中所致的疾病谱及发生重症感染的危险因素、人体感染病毒后的免疫反应、可能的有效治疗措施和感染控制策略等均有待于明确。由于SARS病毒能在体外干燥的物体表面存活2～3 d，在人粪便中存活2～4 d，接种时间为7～10 d，其他的HCoV接种时间为3～5 d[59,62,63]；故推测HCoV-EMC/2012的接种时间应在10 d内，WHO和HAP建议的感染控制措施是对暴露人群监测至少10天，实施常规的接触与空气传播预防措施，以及接触动物后的简单的个人手部卫生措施[6,53,54,64]。

由于16例确诊的患者在发病地点(在沙特阿拉伯、约旦、卡塔尔和英国均有病例被发现)和时间上(2012年4月到2013年3月)跨度很大，是否HCoV-EMC/2012在人群中存在广泛的无症状携带、亚临床感染和轻症感染有待于大规模的流行病学调查[6]。16例患者中有2例仅有轻度的呼吸道症状，提示轻症感染可能也较为常见[8,56]。HCoV-EMC/2012是否如同SARS在儿童人群中导致感染症状较轻而未能被重视与及时发现，有待于对HCoV-EMC/2012流行人群的进一步监测[65]。另外，HCoV-EMC/2012由于是新出现的病毒，在人群中感染流行后是否发生变异以利于更适应人体的环境导致更大范围的流行，或者有利于人与人之间的传播，必须在全球进行密切协作监控。

同时，必须对动物界的冠状病毒流行与变异情况、甚至新型冠状病毒流行进行监测，以应对可能存在跨物种冠状病毒流行[5,16,17,32,33,37,44,66,67]。HCoV-EMC/2012的出现，对HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和CoV-HKU1在人群中的流行及基因变异的可能影响，需要有密切的监测。

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10.3969/j.issn.1673-5501.2013.02.000

上海市卫生系统重点学科建设项目基金：08GWZX0102

复旦大学附属儿科医院 上海，201102

朱启镕，E-mail：qrzhu@shmu.edu.cn

2013-02-15

2013-03-27)

张崇凡)