氨基酸分析在细胞工艺研究中的应用

刘铁成

(1.哈药集团技术中心 黑龙江哈尔滨 150012;2.哈药集团生物工程有限公司 黑龙江哈尔滨 150012;3.东北林业大学 黑龙江哈尔滨 150040)

氨基酸分析方法多种多样,比较常见的方法有高效毛细管电泳法[1],串联质谱法[2],高效液相色谱荧光法[3],等多种方法。这其中柱前衍生氨基酸的高效液相色谱应用最为广泛[4]。柱前衍生很早就有报道[5]。本文采用美国沃特斯公司提供的商品化氨基酸衍生试剂盒,采用C18反相色谱柱进行[6]。其原理就是因为多数氨基酸本身没有显色集团,因此需要加入衍生试剂使被检测的氨基酸能够显色。提高检测灵敏度。通过高效液相色谱分离。通过标准样品进行标定,计算准确含量。这样的方法可以测定细胞培养也中流离的氨基酸含量。因此能够反映出细胞培养后期,某些氨基酸是否缺失。通过对缺失氨基酸的补充,延长细胞培养周期。提高细胞分泌蛋白能力。

1 实验材料

图1

图2

表1

AccQ·Tag Chemistry Package(化学品包,P/N WAT052875)氨基酸分析试剂盒;安捷伦1200高效液相色谱;CHO细胞培养后期培养液样品。

2 实验方法

(1)衍生方法如下。清洁的移液器移取10μl已稀释的标样或样品注入清洁的6×50mm衍生管(P/N WAT007571)底部。换一清洁的微量移液管头,加70μl AccQ·Fluor 硼酸盐缓冲液(Buffer1)到衍生管中,涡旋混合。另换一清洁的微量移液管头吸取20μl刚刚配好的AccQ·Fluor衍生剂(2A),在涡旋状态下加到衍生管中,并保持涡旋混和10秒钟。在室温下放置1分钟。将衍生管用石蜡膜封口,放在 55℃烘箱内加热10分钟。加热后,取出,即可用于进样。(2)色谱条件。色谱柱:WATERS氨基酸分析柱3.9×150mm;柱温:37℃;紫外检测波长:254nm。

3 结果分析

通过对无血清培养液培养CHO细胞不同蛋白克隆表达的样品,测定氨基酸含量变化。

氨基酸标准品:(如图1)

①无血清培养液;②无血清培养液培养CHO细胞载体后期;③无血清培养液培养CHO细胞表达BP326蛋白后期;④无血清培养液培养CHO细胞表达Erbitux蛋白后期;⑤无血清培养液培养CHO细胞表达Enbrel蛋白后期;⑥无血清培养液培养CHO细胞表达EPO蛋白后期。根据氨基酸分析同样用CHO细胞为载体,表达不同蛋白时细胞培养后期氨基酸变化情况结果分析,把取得的数据绘制成表格如下:(如图2)

从图表中明显可以看出,有些氨基酸在CHO细胞培养后期被正常消耗,呈现出逐渐减少。但是同样以CHO细胞为载体表达不同蛋白的细胞培养后期结果并不相同。整体消耗明显下降的有丝氨酸、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸。含量较高未被明显消耗精氨酸、脯氨酸、赖氨酸。明显增加的是丙氨酸。其他氨基酸略有消耗。

因此在进行不同表达蛋白生产时细胞培养后期添加比例就可以根据以上事宜结果氨基酸的消耗进行添加。设计细胞培养后期添加比例选取CHO-EPO为例结果如表1:

通过细胞培养后添加缺失的氨基酸和未添加相比,产量明显提高。添加后的产量是未添加的1.45倍。因此,在细胞培养过程中尤其是细胞培养后期添加缺失的氨基酸可以明显提高表达蛋白的产量。

[1]沈佐君,吴琳.高效毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸.中华医学检验杂志,1998(3).

[2]张轶雯,倪君君,相婷,高慧媛,李玮,吴立军.串联质谱法测定血清中20种游离氨基酸含量.检验医学与临床,2010(19).

[3]桂莉,田洪,郑健,段炜,叶枫.高效液相色谱荧光法同时测定小鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质.第三军医大学学报,2009(8).

[4]屠春燕,赵珺,葛佳璐,吴燕娇,唐美华,袁艳娟,韦萍.李寿椿.新型衍生试剂柱前衍生氨基酸的高效液相色谱分析分析测试学报,2008.