利用改良的氨基酸测定方法检测野生红小豆(Vigna angularis)品系氨基酸含量
2013-12-23陈禅友
彭 海,张 静,陈禅友
(江汉大学 系统生物学研究院; 湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心,湖北 武汉 430056)
红小豆又名红豆、赤小豆或赤豆,其具有降低胆固醇[1-3]、调节人体雌激素水平[4]、用作中草药[5]等功能,用途十分广泛。红小豆起源于我国,资源十分丰富。本研究在武汉市蔡甸区洪北乡胜洪村发现了一个野生红小豆种群,并对其进行了表型性状调查,发现在色泽、种子大小、株高等方面存在明显变异[6]。经过分株单选,从这个野生红小豆种群中获得了10 个品系。
红小豆含有超过20%的蛋白质和各种氨基酸,人体必须赖氨酸含量也较高,因此,氨基酸含量是红小豆品质的一个重要指标。虽然传统的红小豆测定方法有液相色谱法和比色法两种方法,但前者设备与试剂费用都较高,难以大量推广,而后者操作所需要的液体体积较大,比较粗放,误差较大,也难以实现自动化与批量处理。为此,在本研究中,对传统的比色法测定氨基酸含量进行了改良,使操作体积缩小到微升级别,使操作方便程度大大提高,结果精度也显著改善,同时降低了成本,也有助于自动化操作。利用改进的方法,测定了所筛选的10 个红小豆品系的氨基酸含量,为育种选择奠定了基础。
1 实验部分
1.1 材料
10 个初步筛选的野生红小豆品系,分别编号为S1 ~S10,于2012 年在海南统一繁殖获得种子。
1.2 仪器
全波段超微量分光光度计(QuanWell,Q5000 型);PCR 仪(ABI,2700 型);恒温金属浴(MiniT-100,杭州奥盛仪器有限公司)。
1.3 试剂
3%茚三酮试剂、氰酸盐缓冲液、标准氨基酸、0.3%抗坏血酸溶液。
1.4 标准曲线的制备
取0. 2 mL PCR 管18 支,按表1 加入各试剂,震荡混匀,在PCR 仪中100 ℃保温12 min,取出后立即置冰上,于每支PCR 管中加入150 μL 95%乙醇,震荡混匀,使加热时形成的红色产物被氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色。于570 nm 波长下测其光密度(以空白管为参比),以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程。
1.5 样品制备
取30 个1. 5 mL 的EP 管,称量空管的重量,选取S1 ~S10 红小豆各3 粒,分别置于30 个EP 管中,用带研磨杵的电钻将样品研磨成粉状,再称量各EP 管重量,减去空管的重量,即为加入红小豆的重量。向EP 管中加蒸馏水1 mL,于恒温金属浴100 ℃加热20 min 以提取游离氨基酸,之后置冰上冷却,1 000 r/min 离心1 min,取上清于另一干净的1. 5 mL EP 管中,恒温金属浴上100 ℃加热10 min,用水补至1.5 mL。
1.6 样品测定
取33 支PCR 管,其中30 支分别加入S1 ~S10的提取液5 μL,另外3 支加5 μL 蒸馏水,然后在上述33 支PCR 管中分别加入NaCN 缓冲液、水合茚三酮各5 μL,置PCR 仪中100℃保温12 min,取出立即置冰上冷却,分别加50 μL 95%乙醇,摇匀,以空白作参比,在波长570 nm 下测其光密度。根据光密度查标准曲线(或用回归方程计算),求出提取液中氨基酸浓度。
1.7 数据分析
式中,C 为由直线方程计算的值,即氨基酸浓度(nmol/μL);V 为样品提取液经稀释后的总体积(μL)=1500 μL;W 为样品重(g)。
2 结果与分析
2.1 氨基酸标准曲线
采用超微量分光光度计进行吸光度值的测定,由于最后测定只需要1 μL 的量。因此,在制定标准曲线时,各反应组份体积都控制在15 μL以内,测定结果见表1。从表1 可以看出:标准品的吸光度变异较小,均不超过0.000 2,表明改进方法的技术重复内是稳定的。根据表1 的结果,进行了线性回归分析,结果如图1 所示,获得了吸光度与氨基酸浓度之间的线性回归方程为:Y=0.5561x +0.0049。该线性回归方程的相关系数高达99. 81%,表明本研究建立的回归方程可靠,从另一侧面反应了本研究改进方法的可靠性。
表1 氨基酸标准曲线的测定
图1 氨基酸浓度标准曲线
2.2 野生红小豆品系氨基酸含量
利用改进的氨基酸测定方法,对10 个红小豆品系进行了测定,结果见表2。利用表2 结果进行了统计分析,计算了各品系氨基酸含量的平均值、标准差,并在1%和5%的水平进行了多重比较,结果见表3。从表3 可以看出:所筛选的10个红小豆品系的氨基酸含量存在明显差异,最高是S10,达到222. 95 μg/g,最低是S5,为191. 53 μg/g。该批红小豆是从野生红小豆种群中筛选出来的,从形态等方面看,多样性较高[6],推测在氨基酸含量方面,可能存在较大变异,本研究证实了这一点。从统计分析结果来看,不论是在5%还是1%的显著水平上,这10 个野生红小豆品系间的氨基酸含量差异都达到了显著水平,表明它们之间的氨基酸含量差异是真实存在的,育种筛选是可行的。
表2 S1~S10 红小豆品系氨基酸含量测定结果
表3 S1~S10 红小豆品系氨基酸含量统计分析
3 讨论
3.1 氨基酸测定方法的改进
传统的氨基酸测定方法采用比色皿进行比色,测定时需要的体积至少为1 mL,这方面的实例很多[7-8]。另外一些学者则采用液相色谱进行测定[9-10]。液相色谱不论是在仪器还是试剂成本上,都是一般实验室难以接受的。比色法成本较低,采用更为普遍。然而,传统的比色法由于操作体积都在毫升级别,所需液体体积较大,所以,在配制反应液时,必须在试管中进行,取样需要移液管进行操作,加热等也必须在水浴锅中进行。所有这些操作都耗时且不方便,水浴加热不精确,冷却过程也较长,这些都是实验误差的来源,使得测量不够准确。本研究中,采用超微量分光光度计进行比色,其突出特点是可以将比色的体积减少到1 μL,即仅为传统检测体积的1/1 000,从而使得整个反应可以在PCR 管中进行,所有操作体积都控制在150 μL 之内,使得整个移液工作可以采用移液枪进行,方便、快捷、准确度高。另外,整个标准曲线和样品测定的反应总体积在100 μL 以内,可以在PCR 仪中对加热温度和时间进行精确控制。当样品数目较多时,可以采用PCR 板进行。这一改进使得所有样品加热和冷却可以同时开始、同时结束,保证了样品间的可对比性。另外,也可以将PCR 仪中加热和冷却按程序进行,即100 ℃加热12 min 后,设置一个4 ℃保存程序,进一步减少了手工操作。从标准曲线的测定来看,重复间变异很小,曲线方程相关系数达到99. 81%,反映了测定的准确性。
另外,上述改进之后,加样可以利用移液工作站自动进行,加热与冷却可利用PCR 仪自动进行,使氨基酸测定自动化与标准化程度大大提高。在食品抽查中有大量样品需要检测,若能实现自动化与标准化,对于检测结果的准确性与及时性都有极大好处,因此,本研究所改进的方法在食品氨基酸检测方面具有潜在的利用价值。
最后,上述改进后,试剂的消耗量减少了数百倍,试验成本大大降低。
3.2 野生红小豆品系氨基酸含量
从已有文献来看,还没有红小豆氨基酸含量的文献报道。查询了中国作物种质信息网(http://icgr.caas.net.cn),从现有保存的839 份红小豆资源来看,氨基酸含量在本研究的变异范围内(222. 95 ~191. 53 μg/g)的资源有522 份,占总资源的62. 22%;小于本研究下限191. 53 μg/g的品系有16 个,占1. 91%;大于本研究的上限222.95 μg/g 的品系有301 个,占35.88%。表明本研究筛选的野生资源中,氨基酸的含量虽然有较大变异,但还是没有能够超过已有资源的氨基酸含量。另外,低于本研究下限的种质资源数量已经很少了,从一个侧面说明,本研究的野生资源的氨基酸含量总体偏低,育种改良空间较大。可与该网站中所登记的高氨基酸含量的亲本进行杂交,从后代筛选出氨基酸含量高且具有野生资源优良抗性的品系,从而实现红小豆氨基酸含量改良的育种目标。
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