超声集成双水相体系提取葡萄籽中的原花青素

张喜峰，李彩霞，张 瑾，张芬琴

河西学院农业与生物技术学院，张掖734000

在葡萄酒加工过程中，每年产生约占葡萄加工量20%～30%的大量皮渣废弃物，其中主要是葡萄皮、种子和果梗等。葡萄籽中含有原花青素、葡萄籽油、白藜芦醇、维生素、单宁等多种功能性成分［1，2］。其中原花青素具有抗氧化，清除自由基，保护心血管，预防高血压等多种药理活性作用［3，4］。

目前原花青素的提取方法有微波萃取、超声波提取、超临界萃取法、膜分离技术、酶解法等［5-7］。双水相萃取技术是基于液-液萃取理论，同时保持生物活性所开发的一种新型萃取分离技术。具有分离条件温和、操作简单、易连续操作、易保持分离物生物活性、易与其他技术集成等特点［8］。采用乙醇-硫酸铵双水相体系与其他高聚物的双水相萃取相比，具有价廉、低毒、分相清晰的特点，萃取相不含粘度大，难处理的聚合物，并能缩短提取时间，降低提取成本［9］。并通过超声波法良好的提取作用与醇-盐双水相体系相结合，将提取分离一体化［10］。

本实验在建立乙醇-硫酸铵双水相体系的基础上，采用超声波集成乙醇-硫酸铵双水相体系萃取分离葡萄籽中的原花青素，运用Plackett-Burman(PB设计)［11］、最陡爬坡实验以及利用Box-Benhnken 设计和响应面分析法(Design-expert8.0.5.0 软件)得到双水相萃取原花青素最佳条件。为原花青素工业化制备和葡萄籽综合利用提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

取甘肃滨河食品工业集团葡萄酒下脚料，经挑选、清洗、晒干、粉碎，得到干净的葡萄籽。

无水乙醇、香草醛、甲醇、浓盐酸、硫酸铵均为分析纯(天津市世化工有限公司)，儿茶素为标准品(上海友思生物技术有限公司)。

粉碎机(河北黄骅新兴电器厂);722 型分光光度计(上海光谱仪器有限公司);电子天平(PL203)(梅特勒-托利多上海仪器有限公司);FH3 型恒温磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司);PHS-3C酸度计(北京哈纳科技有限公司);SB120DT 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 乙醇-硫酸铵双水相体系

乙醇-硫酸铵双水相体系参照文献［10］，在水溶性乙醇中加入硫酸铵，利用硫酸铵的盐析作用形成双水相体系，通过改变乙醇与水的比例和盐的用量可以控制双水相体系的形成。

1.2.2 原花青素的超声提取与双水相分离

准确称取2 g 葡萄籽粉末，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入一定量的乙醇和水，浸泡一段时间后，再加入一定量的(NH4)2SO4成相，超声提取一定时间，过滤，滤液于分液漏斗中静置分层，分别测定上相乙醇相和下相清液中原花青素的含量。

1.2.3 香草醛-盐酸法测定原花青素的含量

标准曲线制作:测定方法参照文献［12］，选儿茶素作为标准，分别吸取不同浓度的儿茶素标准溶液0.5 mL，加4%香草醛甲醇溶液3 mL，再加入1.5 mL 浓盐酸，避光反应15 min。以0.5 mL 蒸馏水，4%香草醛甲醇溶液3 mL，1.5 mL 浓盐酸为空白对照，避光反应15 min。在500 nm 处测定吸光值。以反应体系所测吸光值y 为纵坐标，儿茶素含量(mg)为横坐标，做标准曲线，求得回归方程为Y =6.0451X+0.0115，R2=0.9956。1.2.4 样品中原花青素的分析

吸取4% 香草醛甲醇溶液3 mL，浓盐酸1. 5 mL，加入萃取样品液0.5 mL(若浓度较大，可以进行适当倍数的稀释)，避光反应15 min，在500 nm 处测定吸光值。将吸光度代入回归方程计算原花青素浓度，按下式计算出原花青素的提取率Y 和双水相体系的分配系数K。

式中:原花青素提取物质量是指双水相体系中上相原花青素质量(C上V上)。C上和C下是指双水相体系中上相和下相原花青素的浓度。

1.3 试验设计

1.3.1 Plackett-Burman( PB) 实验设计

根据双水相萃取所需要的条件，选择了可能影响葡萄籽原花青素提取的6 个因素:乙醇质量分数，硫酸铵质量分数、料液比、提取温度、超声时间、pH;为对6 个因素全面考察，采用试验次数n =12 的Plackett-Burman 设计，每个因素取高低两个水平，设计情况见表1。

表1 Plackett-Burman 实验因素水平范围Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.3.2 最陡爬坡实验

根据Plackett-Burman(PB)实验设计找出显著因素后，安排最陡爬坡试验，要先逼近最佳区域后再建立有效地响应面拟合方程。最陡爬坡法试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速，经济地逼近最佳区域。可以了解实验因素随试验指标影响的规律性，即每个因素的水平改变时，指标是怎样变化的，找出响应面因素水平的中心点。

1.3.3 Box-Benhnken Design( BBD) 实验设计

以最陡爬坡实验得出的显著因素的较优作为中心点，每个因素在中心点上下适当范围内再取两个水平组合为在最大响应区研究提取原花青素的关键因素，依据Box-Benhnken 实验设计原理进行响应面设计。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 法筛选影响原花青素提取的主要因素

按照6 因素、n =12 次的Plackett-Burman 实验设计表进行12 次实验，实验设计及结果见表2，效应评价

见表3。一般认为影响值比较大的因素对系统的贡献较大，从表3 可以看出，所考察的六个因素对原花青素提取率的影响顺序依次为X2＞X5＞X1＞X4＞X6＞X3，即硫酸铵质量分数＞超声时间＞乙醇质量分数＞超声温度＞pH ＞料液比，其中X3、X4、X6(料液比，超声温度，pH)对结果的影响不大，而X2(硫酸铵质量分数)的影响最为显著。所以，通过Plackett-Burman 试验设计结果可以看出，X2(硫酸铵质量分数)、X5(超声时间)、X1(乙醇质量分数)这三个因素为显著因素，下一步对硫酸铵质量分数、超声时间、乙醇质量分数这三个因素进行最优化的考察，而对X3(料液比)、X4(超声温度)、X6(pH)三个因素不做太多考虑，根据表3 的结果，正效应选高水平，负效应选低水平。下一步通过最陡爬坡试验逼近提取条件的最佳区域。

表2 Plackett-Burman 试验设计及结果(n=12)Table 2 Plackett-Burman design matrix and corresponding results (n=12)

表3 Plackett-Burman 试验因素水平及其效应评价Table 3 Levels and effects of six factors after Plackett-Burman design optimization

2.2 最陡爬坡试验确定响应面因素水平的中心点

因为响应面二次拟合方程在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，所以应先使得显著因素的水平尽量逼近最佳提取条件，再建立有效的拟合方程，最陡爬坡试验正好满足这一需求。

根据Plackett-Burman 主效应分析，在最陡爬坡试验中对A(乙醇质量分数)、B(硫酸铵质量分数)、C(超声时间)3 因素的变化方向，步长作了相应的设计，具体取值和试验结果见表4。从表4 数据可知，原花青素萃取率随关键因素的改变而变化，萃取率最高的为第6 组，说明该组实验的乙醇质量分数、硫酸铵质量分数、料液比接近最优。故选第6 组为中心水平进行后续的响应面优化设计。

2.3 Box-Benhnken 设计显著因素的最优水平

依据最陡爬坡试验设计结果确定因素与水平，利用Box-Benhnken 设计对试验提取条件进行了3因素3 水平的响应面分析优化，各因素和水平见表5。运用Design-expert8.0.5.0软件进行Box-Benhnken 试验设计的实验设计情况及结果见表6。

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Design and results of steepest ascent test

表5 Box-Benhnken 试验因素及水平Table 5 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

表6 Box-Benhnken 试验设计及结果Table 6 The experimental design and results for response surface analysis

12 0 1 1 8.6 23 13 0 0 0 11.1 30.1 14 0 0 0 11 29.1 15 0 0 0 11.3 29.7 16 0 0 0 10.9 29.4 17 0 0 0 10 28.9

2.3.1 回归模型的建立及方差分析

运用Design-expert 软件进行二次回归拟合后，得到以下回归方程:Y =29.54-0.9625A-0.4875B +0. 6C-0. 025AB + 0. 05AC + 0. 2BC-4. 9825A2-3.0825B2-3.1575C2

p-Prob ＞F 值小于0.05，则表明该模型或考察的因素有显著影响，p-Prob ＞F 值小于0.01 则表明影响极为显著。由方差分析表7 可知，模型p-Prob＞F 值小于0.0001，则说明本实验所选模型极为显著。模型失拟项(lack of fit)的p-Prob ＞F 值为0.1141，大于0.05，模型失拟项不显著，说明该模型选择比较合理。乙醇质量分数A(p-Prob ＞F =0.0108)，乙醇质量分数二次项A2(p-Prob ＞F ＜0.0001)，硫酸铵量分数二次项B2(p-值Prob ＞F ＜0.0001)，超声时间二次项C2(p-值Prob ＞F ＜0.0001)，这说明这些因素对模型显著，该方程对实验拟合情况较好。模型决定系数R2为98.04%，表明这3 个因素对原花青素提取率的影响占98.04%，而其他因素的影响和误差占1.96%，该模型的相关度很好，与实际情况拟合良好，此模型可以用于原花青素提取条件的分析和预测。

表7 Box-Benhnken Design 回归模型方差分析Table 7 Analysis of variance of the fitted regression model

2.3.2 响应面交互作用分析与显著因素最佳值的确定

采用Design-expert8.0.5.0 软件绘制了因素之间的等高线图。从图1 中可以看出，图中等高线均呈圆形，则表明AB、AC、BC 交互作用不显著。

通过图1 中的等高线图可以看出，当各因素从四周逐渐趋向于中心点时，等高线图中提取率逐渐增加，则说明各因素的值越靠近中心点时，葡萄籽原花青素的提取率越大，响应值存在最大值，进而说明最陡爬坡试验的中心点取值较合理，回归模型显著。通过Design-expert 软件分析计算得出，当预测的响应值最大时，三个因素的最佳值为:A-乙醇质量分数21.45%，B-硫酸铵质量数23. 46%，C-超声时间45.46 min，预测提取率最大值为29.6%。

图1 因素之间的等高线图Fig.1 Different effects of Contour

2.3.3 验证试验

为了验证建立的模型与实验结果是否相符，根据以上实验中的结果确定的最佳条件进行了3 组验证试验，得到的平均提取率为30.1%，这与预测值29.6%相接近，证明拟合模型能较好的反映原花青素的最佳提取条件。并且与优化前(优化前条件:乙醇质量分数19%、硫酸铵质量数20%、超声时间20 min)提取率相比提高了6 倍。

优化后葡萄籽原花青素的最佳提取条件为:A-乙醇质量分数21.45%，B-硫酸铵质量数23.46%，C-超声时间45.46 min。此时，提取率为30.1%，分配系数为11.5。

2.3.4 双水相体系总质量为1000 g 的放大实验

在2 L 烧杯中加入214.5 g 无水乙醇，234.6 g硫酸铵，1∶7 料液比加入葡萄籽粉末，加水至1000 g，50 ℃温度下超声提取45.46 min，分液漏斗分相，取上相，经过三次平行放大实验原花青素提取率为30.23%。

3 结论

利用Plackett-Burman 实验、最陡爬坡实验和Box-Behnken 实验进行原花青素提取条件的优化，证实乙醇

质量分数、硫酸铵质量分数和料液比对原花青素提取率有显著影响。优化后葡萄籽原花青素的最佳提取条件为:按乙醇质量分数21.45%，硫酸铵质量分数23.46%配制双水相，料液比1∶7，50 ℃温度下超声提取45. 46 min，原花青素的提取率可达30.23%，分配系数为11.5。

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