原癌基因Pokemon及核转录因子E2F3在喉鳞癌中的表达及其临床意义

刘丽英 王琳 闫完平 周合心

喉鳞癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，尤其在我国北方高发，其局部侵袭和颈淋巴转移的特点是造成患者复发或死亡的主要原因［1］。POK 红系髓性致癌因子（POK erythroid myeloid ontogenic factor，Pokemon）作为转录因子参与多种癌基因的转录与调节，在细胞恶性转化过程中起重要作用［2］。核转录因子E2F3（E2Ftranscription factor 3）对细胞周期和DNA 复制过程发挥重要的调控作用，与肿瘤发生发展密切相关［3］。研究表明Pokemon和E2F3在ARF／p53 细胞周期分子通路中起重要调控作用［4］，但在喉鳞癌中的研究甚少。本研究旨在用免疫组化技术，观察Pokemon和E2F3在喉鳞癌中的表达，并探讨两者与喉鳞癌病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2002年11 月至2007年11月年临汾职业技术学院附属医院耳鼻咽喉科诊治的临床资料详实的61例喉鳞癌患者的喉鳞癌组织及对应癌旁正常喉黏膜石蜡包埋标本，其中男52例，女9例；年龄36～71岁，中位年龄59岁；其中声门上型22例，声门型36例，声门下型3例；高分化20例，中分化26 例，低分化15 例；按第7 版UICC TNM 分期标准：T1＋T2 期41 例，T3＋T4 期20例；颈淋巴转移（N＋）17 例，远处转移（M1）1 例。手术切除的喉部病变标本均经病理科两位正高级医师确诊为喉鳞癌。本研究经临汾职业技术学院属附医院科学研究伦理审查委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化染色 将每例喉鳞癌及正常喉黏膜石蜡标本进行连续切片3～4张，片厚4μm，1张行目标抗体染色，1张用PBS代替一抗做阴性对照，其余备用。常规脱蜡水化，置EDTA 缓冲液高压修复，3%过氧化氢甲醇液封闭5min，PBS浸洗3次，每次5分。滴加与二抗相同来源非免疫动物血清封闭10分，PBS浸洗3次，每次5分。滴加一抗4 ℃孵育过夜，PBS浸洗3次，每次5分。室温下二抗孵育20分，PBS浸洗3次，每次5分。二氨基联苯胺（DAB）显色。苏木素复染并脱水封片。Pokemon兔抗人多克隆抗体（ab114074）购自美国abcam 公司，鼠抗人E2F3单克隆抗体（sc－56665）购自美国Santa cruz公司。Pokemon稀释度为1：150，E2F3稀释度为1：500。MaxVision二步法二抗购自福州迈新公司，封闭血清、抗体稀释液及DAB 均购自武汉博士德公司。

1.2.2 Pokemon及E2F3表达的评价标准 Pokemon及E2F3均以肿瘤细胞核定位为主，细胞核着黄色至棕褐色为阳性细胞。采用阳性肿瘤细胞百分比及细胞着色强度双重积分［5］，阳性细胞≤10%，1分；11%～50%，2 分；51%～80%，3 分；≥81%，4分。浅着色1分；中等着色2分；强着色3分。两者分数相加（2～7分），共分为3组：阴性表达（不着色或≤10%细胞阳性着色，不考虑着色强度），低表达（3分），高表达（4～7分），其中低表达组及高表达组归为阳性表达。所有切片经两名正高级病理科医师交叉盲式阅片，光镜下观察大于10个视野，每个视野不小于100个癌或正常细胞。

1.3 随访 本研究随访方式以电话及信件为主，并结合主动随访。末次随访日为2012年11月，中位随访时间66.0（9～120）个月，失访3例。

1.4 统计学方法 使用SPSS13.0软件，率的比较用χ2检验，等级资料用秩和检验，相关性用Spearman秩相关检验，生存分析用Kaplan－Meier法，多因素生存分析用Cox回归模型，风险度分析用非条件Logistic回归模型，所有检验均为双侧，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pokemon及E2F3在喉鳞癌及癌旁正常喉黏膜组织中的表达及定位 在61例喉鳞癌组织中，48例Pokemon 呈阳性表达，阳性率为78.69%（48／61），显著高于其在癌旁正常喉黏膜组织中的阳性表达率15.22%（7／46）（χ2=42.29，P ＜0.001）。E2F3在喉鳞癌组织中的阳性表达率为67.21%（41／61），显著高于其在癌旁正常黏膜中的阳性表达率（28.26%，13／46）（χ2=15.92，P＜0.001）（图1）。

图1 Pokemon及E2F3在喉鳞癌及癌旁正常黏膜组织的表达

2.2 Pokemon及E2F3的表达与喉鳞癌患者的年龄、性别、原发部位、分化程度、TNM 分期及临床分期的关系（表1） 在17例有颈淋巴结转移的病例中，Pokemon阳性表达17例（100%），E2F3阳性表达16 例（94.12%），秩和检验显示Pokemon 及E2F3在转移组中的表达强度明显高于非转移组（P＜0.05）；在中低分化喉鳞癌病例中Pokemon 及E2F3的表达强度也显著增加（P＜0.05）；Pokemon在临床Ⅲ＋Ⅳ期病例中的表达强度明显高于Ⅰ＋Ⅱ期（P＜0.05）。两者阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤原发部位、T 分期、M 分期均无明显相关性。

表1 61例喉鳞癌患者以不同临床特征分组的Pokemon及E2F3蛋白表达比较

2.3 喉鳞癌组织中Pokemon与E2F3表达的相互关系 Pokemon及E2F3在喉鳞癌中共同阳性表达有37例，共同阴性表达9例，经相关性分析显示，两者的表达强度呈正相关趋势，秩相关系数r 为0.404，P=0.001（表2）。

表2 Pokemon及E2F3蛋白表达强度的相关性（例）

2.4 Pokemon及E2F3表达与喉鳞癌患者预后关系 61例患者5年总累积生存率为71.1%，经Kaplan－Meier法进行生存分析，Pokemon阳性表达患者5年累积生存率63.1%，明显低于阴性表达患者的100.0%（χ2=5.40，P=0.02）；E2F3阳性表达患者5年生存率为60.8%，明显低于阴性表达患者的93.1%（χ2=6.67，P=0.01）。生存曲线见图2。

2.5 多因素生存分析 将Kaplan－Meier法分析与预后相关的单因素：患者年龄、颈淋巴转移、病理分级、Pokemon表达及E2F3表达引入Cox回归模型，颈淋巴转移及远处转移最终进入模型，是本组研究患者的预后独立危险因素，而Pokemon 表达及E2F3表达未进入模型，不是本组研究对象的独立预后因素。伴有颈淋巴结转移患者发生预后不良（死亡）的风险是未伴有颈淋巴结转移患者的5.58 倍（95CI%为2.62～11.89，P＜0.001）；伴有远处转移患者发生预后不良（死亡）的风险是未伴有远处转移患者的29.32 倍（95CI%为2.98～288.82，P=0.004）。见表3。

表3 Cox回归模型分析

图2 Pokemon及E2F3表达与喉鳞癌患者累积生存曲线

3 讨论

Pokemon蛋白含有氨基酸的高度保守的蛋白－蛋白互相作用域（BTB域），c端具有锌指结构，参与细胞基因转录调节，并在细胞分化过程中发挥重要作用［6，7］。研究表明Pokemon在实体癌，如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌的癌组织中呈高表达，在肿瘤发生、发展与转移过程中扮演重要角色［8，9］。E2F3是重要的核转录因子，可结合到与细胞周期调控相关靶基因的启动子序列上，从而对细胞周期发挥调控作用；E2F3的这种作用不仅保证正常细胞的分裂增殖，同样也促进肿瘤细胞异常增殖［10］。E2F3在肾母细胞癌、卵巢癌、前列腺癌等恶性肿瘤发生发展中起着重要作用［11～13］。从文中结果看，在喉鳞癌组织中Pokemon阳性表达率为78.69%，显著高于其在癌旁正常喉黏膜组织中的阳性表达率15.22%（P＜0.001）；E2F3在喉鳞癌组织的阳性表达率为67.21%，显著高于其在癌旁正常黏膜中的表达率28.26%（P＜0.001），提示Pokemon及E2F3与喉鳞癌的发生及恶性进展可能有密切关系。

肿瘤的发展过程是多基因参与的过程，其中癌基因的激活与抑癌基因的失活是其发生、演变的重要机制。ARF／p53是细胞周期调节网络中重要分子通路之一。原癌蛋白鼠双微基因2（Murine double minute gene 2，MDM2）可介导p53 泛素化酶解，引起p53 转录下调，然而p14ARF能抑制MDM2，从而维护p53 将细胞周期阻断在G1 期、G2／M 转换期或诱导细胞凋亡的生物学功能［14］，因此p14ARF是p53的重要调控因子。Zindy等［4］利用凝胶电泳迁移实验确定Pokemon可直接特异结合在p14ARF的寡核苷酸上并抑制其活性，且呈剂量依赖。因此Pokemon 可通过自身上调表达，导致ARF下调表达，进而使MDM2上调表达，最终抑制p53表达，致使细胞增殖调控失效，促进肿瘤恶性增殖及转移［2］。本研究显示，在颈淋巴结转移、临床Ⅲ＋Ⅳ期及中低分化的喉鳞癌病例中Pokemon表达明显增强（P＜0.05），与其在口腔鳞癌［15］、非小细胞肺癌［16］、鼻咽癌［17］的研究结果相似，提示喉鳞癌侵袭转移这一恶性演变过程中，Pokemon上调表达可能是重要的分子事件。

E2F3作为核转录因子参与两条主要肿瘤监控网络，即p14ARF－mdm2－p53和p16ink4a－cycD／cdk－pRb－E2F，调节细胞增殖和肿瘤监视反应。E2F3活性受肿瘤抑制因子Rb蛋白磷酸化调控，当Rb磷酸化时，E2F3被释放活化，使细胞周期顺利通过G1／S 期，促进细胞增殖，而E2F3 缺失条件下p53活性增强［18～20］。本研究结果显示，在伴有颈淋巴结转移及中低分化的喉鳞癌病例中E2F3表达强度增强（P＜0.05），提示E2F3可能也参与了喉鳞癌侵袭转移的恶性发展过程，这可能与E2F3异常表达，致使肿瘤监控网络紊乱有关。此外，本研究结果显示Pokemon及E2F3 在喉鳞癌组织的表达强度呈正相关趋势（P=0.001）。由此推测，Pokemon及E2F3可能在以上分子通路中起到协同调控作用，共同抑制p53，引发喉鳞癌细胞周期紊乱，促进细胞恶性增殖及转移。

结合生存随访资料，Pokemon及E2F3阳性表达患者5年累积生存率均明显降低（P＜0.05），与其在非小细胞肺癌的研究结果一致［21］。然而，经Cox回归模型分析，两者并非喉鳞癌患者预后的独立影响因素，是否与观察例数偏少有关，还有待今后进一步验证。

综上所述，Pokemon及E2F3不仅与喉鳞癌发生及恶性进展相关，还与患者预后相关。但两者在p53分子通路中如何发挥协同作用，或与其他结点基因之间有哪些转录调控关系，目前尚不明。两者能否作为喉鳞癌发病机制及分子靶向治疗中的新指标还需深入研究。

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