虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测研究

张阵阵 栾 洁 汪家春 储智勇

海军医学研究所，上海 200433

虫草属Cordyceps （Fr.）Link 是一大类昆虫病原真菌，其特定的菌感染特定的昆虫后才成为具有重要的药用价值的冬虫夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]，该属伪品种类繁多，品质高低各异[1]。 虫草属的种质资源丰富，属间物种的形态极其相似， 但仅有蝙蝠蛾科虫草为 《中国药典》2010 年版规定的冬虫夏草。 现代药理药效学研究显示，蝙蝠蛾科虫草对吞噬肿瘤细胞的能力是硒的4 倍，所含的虫草素能明显增强红细胞黏附肿瘤细胞的能力，抑制肿瘤生长和转移，明显提升白细胞和血小板的数量，可辅助治疗鼻咽癌、肺癌、白血病、脑癌等恶性肿瘤；减轻组织水肿，可多用于脑水肿的辅助治疗， 防治急性肾功能衰竭等疾病，预防和控制慢性支气管炎、肺源性心脏病，迅速改善放、化疗后的呕吐恶心、头发脱落、失眠等症状。 另外，蝙蝠蛾科虫草所含的特有成分虫草多糖为免疫调节剂，临床治疗及保健用途广泛。 在美国，因其对于恶性肿瘤预防控制的特殊贡献，已将其列为抗肿瘤新药，目前已进入临床三期的研究[2-3]。

因受自然条件的限制，天然蝙蝠蛾科虫草资源日益紧缺，价格昂贵，一些不法分子利用劣质或亚香棒虫草代替蝙蝠蛾科虫草， 其治疗效果受到伪品及劣质品严重影响，甚至对人体产生毒副作用，鉴别和评价同属不同科的虫草显得尤为重要[4]。 目前，其检测方法多为生药学鉴定，薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等主要化学方法鉴定，分子水平鉴定也开始进行[5-8]。

药用真菌虫草属的DNA 指纹图谱检测方法中所采用的放射显带方法和荧光显带方法具有一定的局限性，放射显带方法对环境和实验人员均有高污染的风险，而荧光显带方法所需要的仪器昂贵，难以普及。 另外，低污染而应用普遍的传统聚丙烯凝胶电泳银染显带方法操作时间长、步骤多，采用试剂繁多，易造成显带背景颜色浓、分辨率低、条带模糊的情况，导致显带结果不准确。本文分别对虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶终浓度、胶电泳步骤、胶固定方案、胶染色方法、胶显色步骤进行分析，确定利于虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶DNA 多态性展现的方案， 现报道如下：

1 材料与仪器

1.1 材料

虫草属Cordyceps（Fr.）Link 样品由海军医学研究所汪家春副研究员鉴定。 丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED 购自Takara 生物公司；尿素（Urea）购自Sigma 公司；硝酸银、剥离硅烷、亲和硅烷购自北京鼎国生物工程公司；引物、接头由上海生物工程技术服务有限公司完成；其余试剂均为国产分析纯。

表1 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶配制情况

1.2 仪器

DYCZ-20A 型电泳槽、DYY-12 型电泳仪电源（北京六一仪器厂），P270 型摇床 （中国科学院武汉科学仪器厂），PCR 仪 （德国Biometra 公司），DK-S12 型电热恒温水浴锅（上海华连医疗器械有限公司），高速离心机（德国Eppendorf 公司），PL3002 型电子天平（METTLER TOLEDO 公司）。

2 方法

2.1 配制缓冲液及常用试剂

2.1.1 TE 缓冲液的配制 用pH 8.0 为10 mmol/L Tris-HCl及1 mmol/L EDTA 配制，配制溶液高压灭菌后室温保存。

2.1.2 5×TBE 缓冲液的配制 在800 mL 双蒸水中加入Tris、硼酸和pH 为8.0 的EDTA，定容至1 L 后室温保存。

2.1.3 1 mmol/L Tris-HCl 的配制 在双蒸水中加入Tris-HCl，双蒸水取800 mL，用浓HCL 的剂量调节pH 值，定容至1 L 后室温保存。

2.1.4 5 mol/L EDTA 的配制 称取186.1 g 乙二胺四乙酸二钠盐·2H2O 溶于800 mL 双蒸水， 用NaOH 的剂量调节pH 值，调至pH 8.0，定容至1L 后室温保存。

2.1.5 变性上样缓冲液的配制 在98 mL 去离子甲酰胺溶液中加入2 mL EDTA 溶液，EDTA 溶液为pH 8.0， 再分别加入50 mg 溴酚兰和50 mg 二甲苯氰。

2.1.6 40%丙烯酰胺储液（19∶1）的配制 50 mL H2O 中加入丙烯酰胺和2 g N，N′-亚甲叉双丙烯酰胺， 加热到37℃使之溶解，用定性滤纸过滤定容至1 L 后，棕色瓶里4℃保存。

2.1.7 显影液及染色液的配制 将60 g 碳酸钠加入2 L 的双蒸水中，放入冰箱4℃保存，在显色时即刻加入甲醛溶液和硫代硫酸钠溶液，震荡均匀后配制成显色液；在1 L 的双蒸水中加入硝酸银和甲醛溶液，充分溶解后配制成染色液。

2.1.8 不同比例硝酸银溶液的配制 1 L 所配制的染色液中分别加入1、2、3、4 g 的硝酸银，配制成浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的溶液。

2.2 测序凝胶板的制备

分别用亲和硅烷溶液和浸透剥离硅烷处理相应的测序凝胶板，建立黏附和分离功能的测序凝胶板。

2.3 凝胶的制备

先用适量双蒸水溶解尿素，再加入丙烯酰胺和N，N’-亚甲叉双丙烯酰胺混合溶液 （Acr&Bis） 溶液和10×硼酸（TBE）缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2 mL，并用0.45 mm的滤膜过滤， 然后再加过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）。 表1 为配制3%～6%不同聚丙烯酰胺凝胶浓度所 需 尿 素、Acr&Bis、10×TBE 缓 冲 液、10%过 硫 酸 铵、TEMED、双蒸水的配方。

2.4 测序凝胶银染显色步骤

2.4.1 胶固定 将聚丙烯酰胺凝胶板放入容器中，用配制号的固定溶液浸没，用摇床振荡至标记样品的染色带小时。

2.4.2 胶染色 将固定好的聚丙烯酰胺凝胶分离，对出现分子指纹显色的聚丙烯酰胺凝胶板进行漂洗， 时间控制在6 s以内，漂洗好后即刻放入配好的染色液中进行染色，摇床充分震荡15 min。

2.4.3 胶清洗 用双蒸水充分清洗， 具体方法为振荡洗胶3次，每次5 min。

2.4.4 胶染色终止 终止显色反应，将聚丙烯酰胺凝胶放入终止液中，固定凝胶并干胶。

3 结果

3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果

聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%时， 分子迁移率和多态性均符合虫草属分子的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测需要，见图1。银染中胶显色步骤中显影液为强碱NaOH 和0.5%的甲醛溶液，且NaOH 的浓度为2%。

图1 部分虫草属样品6%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染图

3.2 不同Ag+浓度对虫草属DNA 聚丙烯酰胺电泳多态性显示的影响

由表2 可见，虫草属DNA 在0.3%Ag+浓度的聚丙烯酰胺凝胶多态性最佳，多态性条带数达到80 以上，且染色背景清晰。

表2 不同Ag+浓度对虫草属DNA 聚丙烯酰胺电泳多态性显示的影响

表3 常见几种方法对虫草属DNA 聚丙烯酰胺电泳多态性显示的影响

3.3 常见几种方法对虫草属DNA 聚丙烯酰胺电泳多态性显示的影响

由表3 可见， 虫草属DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用方法3，即固定、染色、显色三步时聚丙烯酰胺凝胶多态性显示最佳，且节约染色时间，操作及保存方式简单。

4 讨论

中药材的真假、质量的好坏，会直接影响临床应用的效果和患者的生命安全，对此，李时珍早就有“一物有谬，便性命及之”的名言。 所以对于中药材的鉴别有着十分重要的意义。 中药材的鉴别方法有很多，通常可分为对植物自然形态的鉴别，对炮制药材外表性状的鉴别，用显微镜观察微观结构的鉴别，以及化学分析、生物测定等鉴别方法。 近年对中药质量的评价方法进展很快，有用药效学、免疫活性以及化学模式识别结合药效学、DNA 指纹图谱等方法评价中药的质量[9]。 DNA 指纹图谱技术是以生物基因组DNA 序列多样性为基础，研究不同物种间遗传差异的一项技术。 生物在长期进化过程中由于各种原因，在基因组水平上产生了广泛的变异，在物种间甚至个体间产生了高度多态性， 这种多态性不因组织器官和个体发育而改变，可以通过对相应位点或片断的考查检出，通过多态性图谱的形式表现出来。 我国中药产业化、规范化、标准化是中药现代化的必由之路，中药材品质鉴定是中药质量控制的首要环节，寻找科学有效的鉴定方法是实现中药现代化迫切任务。 特别是近年来药用虫草的研究和应用很广，受利益驱使，一些不法分子利用劣质或亚香棒虫草代替蝙蝠蛾科虫草，因此对虫草属的鉴别和品质鉴定尤显重要[10-12]。

本文所采取的虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法所采取的银染法，是利用银离子可与核苷酸结合的特性，甲醛能使银离子在碱性环境下还原，从而显现虫草属聚丙烯酰胺凝胶中的DNA 指纹片段。 与同位素检测显带相比较，其灵敏度虽低于同位素，但完全可达到检测要求，避免了同位素的危害。 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色既可避免接触诱变剂（溴化乙锭），也可免受同位素的辐射，实用性强[13]。与荧光染色检测方法相比，解决了荧光染色检测方法费用高额的矛盾，易推广普及。 另外，与传统的四步法（固定、染色、显色、终止）相比较，节省了时间，提高了效率；同时，与二步法（合并固定于染色为一个步骤的方法）相比较，该方法能检测到虫草属小分子量的多态性，得到了高分辨率的虫草属DNA 指纹。 因此，各个物种分子多态性分布不同，需要进行特定性条件的摸索，以建立适合的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染条件和方法。

虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法具体实验操作中还有以下体会： ①凝胶测序板的制备需要单向处理，不可擦拭太过用力，否则会导致玻璃硅烷蒸发，造成聚丙烯酰胺凝胶脱落于测序版；制备测序板时，两种处理溶剂玻璃硅烷和亲和硅烷要戴不同手套处理，严谨敷料的交叉污染，避免聚丙烯酰胺凝胶撕裂；测序板上的残留聚丙烯酰胺不要用刀片刮去， 以免划伤， 用10% NaOH 浸泡30 min 后除去即可。 ②在凝胶制备过程中，需要溶解的尿素不可加热温度过高。 如果确需加热则应等溶液完全冷却后，再可加入TEMED 和过硫酸铵；灌制凝胶的过程中要方式微小气泡的产生，确保聚丙烯酰胺光滑无气泡，才可以保证测序结果的可靠性。

总之，笔者研究表明，需根据每个物种分别摸索条件，才可以得到稳定、重现性好、特异性强的结果。 本研究建立了虫草属聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的方法，为虫草属植物的鉴定及品质评价研究技术平台的建立奠定了基础。

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