蜂蜡麻油敷料对大鼠皮肤创面愈合的影响

刘纯娥，李炳辉，邹新华，冯自波，李春亭，潘青云，陈洪平，刘 浩

慢性皮肤溃疡又称难治性溃疡，创面多经久不愈。用蜂蜡麻油作为基质或载体，加中药制成的软膏治疗皮肤溃疡创面，临床应用疗效显著。蜂蜡麻油混合物是否具有促进皮肤溃疡创面愈合的作用，我们进行了大鼠皮肤溃疡的实验性研究，为功能性敷料提供循证医学的依据。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠20只,体质量（250±20）g，雌雄各半,购自武汉大学实验动物中心(动物许可号SCXK鄂2008-0004）。

1.2 实验材料 蜂蜡麻油敷料由华中科技大学同济医学院附属梨园医院创面修复科提供，由适量的蜂蜡、天然植物提取物麻油等经过一定工艺配置，涂布无菌纱布，经环氧乙烷灭菌而成。麻油是纯度为100%的药用麻油，蜂蜡是熔点为66 ℃的药用蜂蜡。均购自武汉创新工业有限公司。

1.3 试剂 表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF)抗体及SP 免疫组化试剂盒均购自北京中彬金桥生物技术开发有限公司。酶联免疫吸附测定法（ELISA）采用夹心法酶联免疫吸附法，试剂盒购自武汉博士得公司，产品编号DY3214。预先包被的抗体为单克隆抗体，克隆号26503.11。氢化可的松注射液购自天津金耀氨基酸有限公司,生产批号0701042。

1.4 主要仪器 医用微波炉、抗原修复盒及湿盒、酶标仪型。

2 方法

2.1 造模 SD 大鼠适应性喂养3 d。备皮，于大鼠背部脊柱两侧手术刀切除皮肤及皮下组织，深达深筋膜，制造3个面积为1.8 cm×1.8 cm的创面。经股部肌注氢化可的松4 mL/kg，连续3 d，延缓创面愈合。2.2 治疗方法 左上侧创面设为生理盐水敷料组，右上侧为凡士林敷料组，左下侧为蜂蜡麻油敷料组。常规消毒，无菌敷料包扎，绷带固定，每隔2 d换药1 次。换药前摄像，以测定皮肤溃疡面积。每隔1周在无菌条件下，取标本1次，生理盐水清洗，无菌纱布沾干。一部分经4%的中性甲醛固定用作免疫组织化学研究。另一部分放入-80 ℃液氮冰箱，作酶联免疫吸附实验研究。大鼠常规饲养,自由饮水、进食，治疗时间为30 d。

2.3 免疫组织化学染色 4%的中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片(厚4 μm)。行免疫组化SP 法，经脱蜡、修复、标记抗体、DAB 显色、苏木精浅淡复染等。实验过程遵说明书进行，阳性着色为棕黄色颗粒。

2.4 酶联免疫吸附测定法测EGF 含量 组织匀浆后，离心去除沉淀，取上清行酶联免疫吸附测定法来测定标本中蛋白质的含量，在调至相同蛋白质的含量后测定EGF含量。实验过程参照说明书进行。

2.5 创面愈合率计算 创面面积测量使用加拿大VEV公司创面面积测量软件，创面愈合率=（治疗前面积-治疗后测量面积）/治疗前面积×100%。

2.6 统计方法 用SPSS18.0 软件作统计分析。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为显著性差异标准。

3 结果

3.1 创面愈合率 第7 d创面愈合率由低到高依次为生理盐水组、凡士林组、蜂蜡麻油组（P ＞0.05)。第14 d创面愈合率由高到低为蜂蜡麻油组、凡士林组、生理盐水组，且蜂蜡麻油组与凡士林组、生理盐水组比较均有显著差异（P＜0.01）。第21 d时创面愈合率顺序同第14 d，蜂蜡麻油组与生理盐水组比较有显著差异（P ＜0.01），与凡士林组比较有显著差异（P ＜0.05）。实验全程，生理盐水组与凡士林组均无显著差异（P＞0.05)。见表1。

表1 不同阶段3组大鼠皮肤创面面积及愈合率比较(x±s，n=20)

3.2 创面EGF 含量 第7、14、21 d 创面EGF 含量，蜂蜡麻油组＞凡士林组＞生理盐水组，且蜂蜡麻油组与凡士林组、生理盐水组比较均有显著差异(P ＜0.01)，而凡士林组与生理盐水组比较无显著差异。见表2。

3.3 EGF的表达 EGF在细胞的胞浆中均有表达，第0、7 d免疫组化SP法染色无差异。第14、21 d，生理盐水敷料组和凡士林敷料组呈浅棕黄色，蜂蜡麻油敷料组呈棕黄色反应，见图1。

免疫组化定量分析 根据组间来看，于7、14、21 d EGF 浓度的比较，差异显著（P ＜0.001），且蜂蜡麻油组与凡士林组(P ＜0.001)、生理盐水组比较均有显著差异(P ＜0.001)，而凡士林组与生理盐水组比较无显著差异(P=0.1878)，见表3。

4 讨论

慢性皮肤溃疡创面难以愈合，局部治疗是手段之一。一些保护剂、抗生素、维生素、微量元素制剂虽被广泛应用，但基本停留在等待创面自然愈合阶段，促进创面愈合作用十分有限。目前国内用于治疗慢性皮肤溃疡创面的以中药制剂膏剂为主，功能性敷料甚少。国外敷料临床作用并不显著，且价格昂贵。中医外治体表溃疡历史悠久，经验丰富，对促进创面修复有着独特的理解和丰富的临床经验。开发利用祖国医学的蜂蜡麻油混合物作为功能性敷料，疗效好、价格低，符合中国国情。

表2 不同时间3组大鼠创面EGF浓度（pg/mL）比较(±s，n=20)

表2 不同时间3组大鼠创面EGF浓度（pg/mL）比较(±s，n=20)

注：与生理盐水组比较，aP＜0.01；与凡士林组比较，bP＜0.01

0 d 7 d 14 d 21 d生理盐水组38.875±2.245 11.250±3.379 14.625±2.490 19.375±3.023凡士林组39.125±3.059 22.375±5.651 20.875±4.963 22.625±5.467蜂蜡麻油组35.750±2.011 51.625±8.472a、b 42.250±7.554a、b 52.875±8.672a、b

图1 不同时间大鼠创面EGF免疫组化染色(X40)

表3 不同时间3组大鼠创面免疫组化定量EGF浓度（pg/mL）比较(x±s，n=20)

表皮生长因子是美国的Cohen于1962年在小鼠的颌下腺中发现的一种活性成分。大量的国内外研究已证实，EGF 具有促进创面愈合的作用。如Sanz Garcia S 等通过动物实验表明[1]EGF 通过与细胞膜上的EGFR 相结合，形成受体-EGF 复合物，经过自磷酸化等一系列生化反应，诱导和直接调控细胞增值，启动创面修复的过程。有人发现，在需要修复的局部组织内，EGF会明显积聚，有利于创面的早期快速修复。表皮生长因子表达量与创面愈合呈正相关。

1962 年Winter 发现，湿性环境有利于创面成纤维细胞增殖、表皮细胞迁移爬行、血管生成、生长因子发挥作用和基质合成沉积。麻油性甘、凉，具有生肌肉、止疼痛、消痈肿、下热毒、补皮裂之功效，现代药理研究，麻油能提供组织生长需要的营养成分，改善慢性溃疡创面负氮平衡[2]，促进创面愈合。麻油纱布贴敷创面后再包扎，能够有效的防止创面水分的蒸发，使创面保持一定的湿度，处于近似生理环境的条件下，通过无损伤的液化排除坏死组织，有利于创面上皮细胞的生长。同时，麻油可以减少创面的渗出，预防感染，减少纱布与皮肤创面粘连，有利于创面的愈合。蜂蜡，味甘，性微温，具有收涩，敛疮，生肌，止痛等功效，外用于溃疡不敛，臁疮糜烂，创伤，烧、烫伤等。付辉等通过动物实验观察发现[3]，用蜂蜡制成的软膏能明显提高慢性皮肤溃疡创面新生毛细血管数，改善创面微循环，加速创面愈合过程。王会芹等运用蜂蜡膏（蜂蜡和麻油组成）治疗烫伤，效果显著[4]；万明才等用于促进创面愈合的生肌液中，含有蜂蜡和大剂量的麻油[5]。

本研究中，第7 d、14 d、21 d时，3组EGF含量比较，蜂蜡麻油敷料组高于凡士林和生理盐水敷料组，而创面愈合率则是蜂蜡麻油敷料组大于凡士林和生理盐水敷料组。创面愈合率与其成正相关。ELISA测定EGF 含量，第7、14、21 d 麻油蜂蜡组创面EGF含量较凡士林组、生理盐水组升高，差异有统计学意义；免疫组化发现麻油蜂蜡组创面细胞中EGF表达增加，定量分析有统计学差异。生理盐水敷料组与凡士林敷料组EGF含量和创面愈合率比较，均无显著差异。说明麻油蜂蜡可能通过促进创面新生肉芽组织表达EGF来促进伤口愈合，但其具体机制需要进一步研究。

我们认为，蜂蜡麻油膏促进皮肤溃疡创面愈合和增加创面组织EGF表达量的作用，蜂蜡麻油混合物作为一种功能敷料材料，可以临床推广。其机理可能在于：（1）蜂蜡麻油膏能改善慢性溃疡创面负氮平衡，促进创面愈合。（2）蜂蜡麻油膏提高慢性皮肤创面新生毛细血管数，改善创面微循环，加速创面愈合过程。

[1] Garcia SS, Heredero XS, Hernandez AI, et al. Experimental model for local application of growth factors in skin re-epithelialisation[J]. Scand J Plast Recons, 2000,34(3):199-206.

[2] 李俊,王秀成.褥疮的临床治疗[J]. 中国烧伤疮疡杂志,2008,20（2）:135.

[3] 付辉,王新建.蜂蜡膏促进糖尿病新西兰兔创面愈合的实验研究[J]. 大连医科大学学报,2007,(84)：340-343.

[4] 王会芹,刘文.蜂蜡治疗烫伤[J]. 中国社区医师,2008,10（190）:118.

[5] 万明才,冯峰,王新卫,等.生肌液复合封闭负压引流技术对创面愈合的影响[J]. 北京中医药大学学报(中医临床版),2008,15(2):10-12.