香砂六君子汤对脾气虚证大鼠肠神经-ICC间信号转导通路损伤的作用

丁伯龙，齐清会

Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）为胃肠道的起搏细胞，具有胃肠基本节律和起搏功能，参与肠神经系统（enteric nerve system, ENS）信号向平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMC）的转导。ENS 运动末梢、ICC、SMC 构成胃肠运动的基本功能单位[1-2]，蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）是细胞内关键的信号分子，PKA/PKC活性的改变会对胃肠运动产生很大的影响[3]。本实验以苦寒泄泻、耗气破气致脾气虚证模型大鼠为研究对象，观察脾气虚证模型和香砂六君子汤治疗后大鼠肠神经-ICC 间信号转导通路的表达改变，探讨香砂六君子汤治疗脾气虚证胃肠运动障碍的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康成年Wistar大鼠100只，雌雄各半，体质量约200～220 g。由大连医科大学实验动物中心提供。（合格证号：SCXK(辽)2008-0002）

1.2 药物和试剂 山羊抗大鼠c-kit 多克隆抗体（santa cruz, biotech，USA）；兔抗大鼠PKA 多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；小鼠抗大鼠PKC 多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；FITC-驴抗山羊IgG 抗体（santa cruz, biotech, USA）；CY3-山羊抗兔IgG 抗体（sabta cruz, biotech, USA）；CY3-山羊抗小鼠IgG 抗体（santa cruz, biotech,USA）；牛血清白蛋白（BSA）(sigma, USA)；荧光封片剂（vector lab, USA）。中药香砂六君子汤、脾气虚造模用药均购自大连同仁堂，香砂六君子汤成分为：党参10 g，白术9 g，甘草6 g，茯苓9 g，半夏12 g，陈皮9 g，香附6 g，砂仁6 g。

1.3 仪器 TCS-Sp5 激光扫描共聚焦显微镜（leica, Germany）；图像分析软件（leica confocal software, Germany）；SMZ800解剖显微镜（nikon, Japan）；显微解剖镊（regineepoxy, Swiss）。

1.4 方法

1.4.1 脾气虚证模型制作和分组 将100 只Wistar大鼠随机分为对照组20只，模型组30只，恢复组20只，治疗组30只。脾气虚证动物模型制作参考陈小野[4]的苦寒泄泻和耗气破气相结合的方法。⑴用生大黄、厚朴、枳实（2∶1∶1）制成200%浓度煎剂。⑵用广豆根、旋复花、槟榔（3∶1∶1）制成250%浓度煎剂，药温为4 ℃。⑴和⑵交替灌胃，造模前18 d，3次/d，后12 d，4 次/d，每次4 mL。动物表现出外观差、蜷缩、活动减少、反应迟钝、闭眼、毛色晦暗无光泽、四肢无力、腹泻、体质量下降等脾气虚症状，提示脾气虚模型制造成功。对照组用相同剂量的蒸馏水，饮食不限，饲养30 d。造模成功，将脾气虚证动物分成3组：⑴模型组。⑵治疗组，香砂六君子汤水煎剂2 mL/（100 g体质量·d），灌服2周。③恢复组，造模成功后按治疗组方法灌服等量蒸馏水2周。

1.4.2 小肠组织共聚焦显微镜检测 参照Iino S等[5]方法制备小肠肌层全厚标本和免疫荧光标记。造模成功后大鼠脱颈处死，取大鼠上段小肠组织作肠肌层全厚标本。随后进行免疫荧光标记：⑴将标本放于0.5%TritonX-100 的0.05 M Tris-HCL 缓 冲 液（pH7.6）37 ℃孵育4 h。⑵0.01M PBS 漂洗3 次后滴加1%BSA，孵育1 h。⑶0.01 M PBS 漂洗后滴加山羊抗大鼠c-kit多克隆抗体、兔抗大鼠PKA多克隆抗体、小鼠抗大鼠PKC 多克隆抗体，4 ℃避光孵育48 h。⑷0.01M PBS 漂洗后依次滴加FITC-驴抗山羊IgG抗体、CY3-山羊抗兔IgG抗体、CY3-山羊抗小鼠IgG 抗体，室温下避光孵育2 h。⑸0.01 M PBS 漂洗后将标本0.1%多聚赖氨酸包被的载玻片上，荧光封片剂封片后用于激光扫描共聚焦显微镜观测。⑹阴性对照组在步骤⑶中不添加一抗，只用抗体稀释液，余操作步骤同上。

1.5 图像采集 以适合于FITC（488 nm）和适合于CY3（543）的激发波长来观测标本，图像采集的显微镜为200倍。每组取5个标本检测，每一标本随机选取2 个视野，用EZ-C13.70 图像分析软件进行图像三维重建，用Image-Pro Plus 6.0 进行半定量分析。其中PKA、PKC 阳性荧光为红色，c-kit 阳性荧光为绿色。

1.6 数据处理 采用SPSS 13.0 软件对数据进行统计学分析，数据用均值±标准差(x±s)表示，采用方差分析，P＜0.05表示有显著差异。

2 结果

2.1 小肠大体标本肉眼所见 对照组：胃肠形态正常，肠管呈粉红色，无粘连，可见到胃肠蠕动波。模型组：肠管广泛积气，浆膜层充血水肿，呈暗红色，鲜见胃肠蠕动波，并可见少量淡血性腹水。恢复组：肠管内有较多肠内容物，并伴有轻度积气，肠管壁呈轻度淤血表现，肠蠕动减弱。治疗组：胃肠道内有较少量的内容物储存，胃肠壁及其系膜无水肿，肠管色泽红润，并可见到胃肠蠕动波。

2.2 激光扫描共聚焦显微镜检测

2.2.1 小肠肌层ICC、PKA信号通路表达 对照组：在肌间可见丰富的ICC分布，且较均匀，细胞大部分呈双极形，胞体饱满，彼此相互连接成网络样结构，ICC周围有丰富的PKA分布。模型组：ICC数量明显减少，相互连接明显减少，完整的网络样结构遭到明显的破坏，细胞荧光IOD值明显降低，周围可见散在的PKA分布。恢复组：ICC数量较模型组有所增多，偶尔可见到相互连接，网络样结构遭到明显破坏，细胞荧光IOD值较模型组有所升高，其周围PKA表达较少。治疗组：在肌间可见丰富的ICC，分布较均匀，ICC细胞形态结构清晰，可见到完整的网络样结构，其周围可见较多的PKA分布。具体数据见表1。

表1 各组大鼠小肠肌层ICC、PKA信号通路表达分析(x±s)

2.2.2 小肠肌层ICC、PKC 信号通路的表达 对照组：在肌间以及可见丰富的ICC分布，且较均匀，ICC结构清晰，通过彼此发出的多个突触样结构相互连接成完整的网络样结构，在ICC 的胞体和突触周围均有丰富的PKC 分布，密度均匀（图1A）。模型组：ICC数量明显减少，相互连接明显减少，完整的网络样结构遭到破坏，荧光IOD值明显降低，周围可见较少的PKC分布，且分布不均匀（图1B）。恢复组：ICC数量较模型组有所增加，偶尔可见到相互连接，网络样结构遭到破坏，细胞荧光IOD值有所增加，ICC胞体和突触上可见散在不均匀的PKC分布（图1C）。治疗组：在肌间可见较多的ICC分布，并通过其发出的突触相互连接成网络样结构，在ICC的胞体和突触周围可见较多的PKC 分布（图1D）。具体数据见表2。

图1 各组大鼠小肠肌层ICC网络结构和PKC（表达绿色标记为ICC，红色标记为PKC）

3 讨论

中医学理论认为，脾脏的生理功能主要有主运化，化生水谷精微，为后天之本，气血化生之源。现代医学研究发现，脾的功能主要包括了消化吸收、内分泌、代谢、血液、免疫等多系统功能。其中脾主运化为其所有功能的基础。脾气虚时其主运化功能减退，会出现纳呆、便溏、腹胀、精神倦怠、面色萎黄等。在消化系统，脾气虚证会导致消化系统运动功能和内分泌功能的改变，主要表现为胃肠运动功能的改变。ICC 是胃肠起搏细胞，并具有传递神经递质的作用。近年来的研究表明，胃肠神经-ICC-平滑肌网络之间存在着密切的联系，ICC 在伸进信号的转导中起着重要的作用[6]。胃肠神经冲动信号激活肠神经系统释放相应的神经递质，活化的神经递质与ICC 上特定神经递质受体相结合。ICC 将所接收到的神经加以整合分析，再通过与平滑肌细胞之间的缝隙连接，将神经信号传递至平滑肌细胞，平滑肌细胞活化而发生收缩或舒张[7]。ICC 细胞膜上接受传递抑制性神经递质的受体有一氧化氮受体（sGC）、血管活性肠肽受体（VIP2-R），兴奋性神经递质受体主要有毒蕈碱型受体（M2-R）、神经激肽受体（NK1-R）。其中NK1-R和M2-R属于G蛋白偶联受体，通过G蛋白偶联受体-cAMP-蛋白激酶A（PKA）途径或G蛋白-磷脂酶C（PLC）-蛋白激酶C（PKC）途径发挥作用。而VIP和NO则可通过sGC-cGMP-PKG途径发挥生物学效应。蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）是细胞内关键的信号分子[8-9]。研究也已经表明PKA、PKC活性的改变将会对胃肠运动产生很大的影响[3]，脾气虚证致大鼠胃肠运动障碍，蠕动功能减退[10]。

表2 各组大鼠小肠肌层ICC、PKC信号通路表达(x±s)

为研究其信号转导通路的变化，本实验采用c-kit和PKA/PKC抗体行免疫荧光双标记染色，共聚焦纤维镜采集三维重建图像，观测ICC 和G 蛋白偶联受体-cAMP-PKA途径以及ICC和G蛋白-磷脂酶C（PLC）-PKC两种信号转导通路的变化。实验结果显示，对照组大鼠小肠的ICC 网络呈完整的立体的三维网络样结构，荧光反应清晰，ICC主要通过短的突起相互连接成网络样结构，其周围有丰富的PKA/PKC 表达。而脾气虚证时大鼠小肠全厚肌层标本ICC数量明显减少，相互之间出现裂隙，连接结构不连续，ICC胞体的突起数目明显减少，荧光强度明显减弱，其周围表达的PKA/PKC 数目减少，且分布不均匀。提示脾气虚证时ICC 数目减少，ICC 网络受损，胃肠起搏、电活动的基础遭到破坏，以及PKA/PKC信号传导通路受损。导致这种表现得原因可能是：⑴肠管极度扩张致使ICC 受到牵拉，ICC 网络之间的连接结构在高度的拉力下被破坏，PKA/PKC的分布伴随着其被牵拉也发生同样的改变。⑵脾气虚证时，肠道内稳态被打破，随之而出现的内毒素、炎症介质、细胞因子损伤c-kit 和PKA/PKC 抗体的表达以及上述抗体和相应抗原的结合，导致检测出的ICC数量以及PKA/PKC的分布均减少。⑶脾气虚证时，胃肠道组织间毛细血管充血，导致渗出增多，肌间神经丛以及平滑肌间隙增宽，导致ICC及其突起、PKA/PKC相对减少。⑷脾气虚证状态下，ICC凋亡，细胞数目减少，PKA/PKC同样表达减少。

香砂六君子汤为中医健脾益气的代表方剂，临床运用具有悠久的历史，具有增强胃肠平滑肌的蠕动功能，改善微循环、降低组织通透性[11-12]。应用香砂六君子汤治疗后的脾气虚证大鼠的ICC网络样结构基本保持完整，PKA/PKC 蛋白的表达得到恢复。本实验研究结果提示，香砂六君子汤能够修复脾气虚证大鼠小肠ICC、及肠神经-ICC 间信号转导通路的损伤，有效改善脾气虚证状态下胃肠运动功能障碍，促进胃肠运动功能的恢复，从而有效的防治脾气虚证。

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