定向迁移细胞前沿Rac局部化激活的分子调控

李友军，罗孝勇，郭向荣

(湖南师范大学生命科学学院分子细胞实验室，中国长沙 410081)

为阐明Rac 蛋白的激活，表现强烈的时空调控，即在细胞前沿(leading edge)处于激活状态(GTPbound)，而在细胞尾部或两侧，大多处于失活状态(GDP-bound)，作者提出了在细胞前沿，当整合素α4 的胞内区域磷酸化，抑制其与paxillin 结合时，可形成paxillin-GIT1-PIX-PAK 的信号转导通路，从而保证Rac 仅在细胞前沿局部化激活的构想［1-4］.以免疫印迹、荧光双定位试验，确认细胞前沿该信号分子复合物的存在;以Rac蛋白激活试验验证了在纤粘蛋白fibronectin 刺激下，整合素α4 诱导的该信号转导通路可导致Rac 的激活.

1 材料与方法

1.1 实验试剂及材料

大肠杆菌E.coli DH5α，CHO 细胞系本实验室保种;载体EGFP-N1 为本实验室提供;EcoRⅠ和SaIⅠ限制性内切酶，TaqDNA 聚合酶等，均购于Fermentas;单抗购于BD Biosciences，转染试剂X-tremeGENE HP 购于Roche，DMEM 培养基购于Invitrogen，细胞培养皿购于Corning，PVDF 膜为Millipore 产品.

1.2 分子克隆及载体构建

根据EcoRⅠ和SaIⅠ酶切位点设计引物:GIT1 5'(CGGAATTCTGATGTCCCGAAAGGGG)GIT1 3'端引物(GCGTCGACTGTCACTGCTTCTTCTC)，以GIT1-ECFP(Addgene)为模板进行PCR 扩增，反应条件为:94 ℃变性6 min;94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃90 s，反应30 个循环;72 ℃延伸8 min.所得PCR 产物为2 386 bp.经纯化后，用CLONEJET 技术将PCR 产物克隆入pJET1.2/平端载体，转化DH5α 大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒后经EcoRⅠ和SaIⅠ双酶切检测，得到阳性克隆.限制性内切酶EcoRⅠ和SaIⅠ将目的DNA 片断从pJET1.2/平端载体和GIT1 连接好的质粒中切下，连接EGFP-N1 载体(经EcoRⅠ和SaIⅠ酶切并纯化)，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经EcoRⅠ和SaIⅠ双酶切检测，得到阳性克隆，由上海生工公司测序证实.

1.3 细胞转染

将pEGFP-paxillin，pEGFP-GIT1 分别转染CHO 细胞，根据选用的Roche 转染试剂的要求比例以及预实验结果，m(选用质粒)∶V(转染试剂)为1 μg∶1 μL 的比例，计算每张盖玻片上的面积，复合物各组分所需要的量分别为:质粒DNA:0.5 μg;转染试剂:0.5 μL;转染混合物总体积(无血清的培养液溶解):100 μL.依次加入无血清培养液、DNA、转染试剂，三者充分混匀.室温条件下孵育30 min.孵育完成后，去除盖玻片上原有的培养液(但避免盖玻片干燥)，盖玻片置于2 mL 培养皿中，再将转染混合物加到盖玻片，做好标记，37 ℃恒温、5%CO2(体积分数)、湿度适宜条件下培养4 h 后吸掉原溶液，加入新鲜的含血清的完全培养液继续培养24～36 h.

1.4 免疫荧光检测相关蛋白的相互作用

转染良好，则应立即除去培养液，用PBS 洗1～2 次;加入含40 g/L 多聚甲醛的PBS 缓冲液，暗室中固定5 min;用PBS 缓冲液洗涤两次，再向每张盖玻片上分别加入500 μL 含10 g/L 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)的PBS 缓冲液封闭，在室温条件下封闭孵育1 h 左右;用PBS 漂洗两次，转染了paxillin-EGFP，GIT1-EGFP 两组细胞中分别加入10 mg/L 用含10 g/L BSA 稀释的Anti-GIT1 和10 g/L BSA 稀释的Anti-PIX，4 ℃孵育过夜后，用PBS 洗涤3 次;每张盖玻片上分别加入100 μL 用超纯水按体积比1∶100 稀释的羊抗鼠标记罗丹明，室温、避光孵育2～3 h，PBS 漂洗3 次;尼康倒置荧光显微镜(Eclipse Ti-U)下观察、照像.

1.5 免疫印迹检测相关蛋白的相互作用

细胞传代3 组CHO 细胞，24～36 h 后，诱导结束除去培养液，PBS 冲洗2 次;培养皿加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，使细胞充分裂解;低温条件下，刮下细胞转移至3 组微量离心管，其中两组加入Anti-Paxillin，另一组加入Anti-GIT1.抗体孵育完成后，再向每个离心管中分别加入20 μL Protein A/G PLUS-Agarose 冰上摇晃3 h;孵育完成后离心，弃上清，用细胞裂解液洗涤4 次;每组离心管中分别加入20 μL 1×的蛋白质电泳Loading Buffer 混合物(包含了DTT)，在沸水中煮5～8 min;将样品保存在4 ℃冰箱;SDS-聚丙烯胺凝胶电泳;电泳结束后，电转膜，用Bio-rad 凝胶分子成像系统(ChemiDocTM XRS)，选择合适的曝光时间，对PVDF 膜照像.

1.6 Rac 蛋白激活试验

将人的全长PAK cDNA 基因按正确读码框克隆到pEGFP-N2 载体中，转化大肠杆菌感受态细胞筛选阳性结果.将pEGFP-PAK 质粒DNA 转染到CHO 细胞，36 h 后裂解细胞.以抗EGFP 单抗与Protein A/G PLUSAgarose 免疫沉淀.将培养在fibronectinb(5 mg/L)包被的35 mm 培养皿CHO 细胞裂解后，与PAK 琼脂糖珠共孵育，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后，以抗Rac 单抗在分子成像系统上直接检测Rac 蛋白激活.

2 结果与分析

2.1 GIT1-EGFP 质粒构建的结果分析

本文所用的GIT1 基因和Paxillin 均由美国Addgene 购得.以GIT1-ECFP 质粒为模板，引物中加入SalⅠ、EcoRⅠ的酶切位点，对GIT1 基因进行了扩增.DNA 电泳后如图1.

PCR 扩增后全长GIT1 基因为2 388 bp，经拍照检测，目的片段大小正确.由于目的基因片段大小已经达到2 000 bp 以上，酶切位点处于近末端的位置，作者使用直接酶切的办法可能无法正常地切动，经数次尝试均无法连接成功，故采用中间载体pJET1.2/平端载体将目的基因环化，使酶切位点不再处于近末端.该载体具有良好的亲和性，并不会产生不必要的其他DNA 片段.将GIT1 基因与pJET1.2/平端载体连接并转化至平皿，长出菌落后，菌落PCR 筛选出阳性克隆.摇菌，提取质粒;将GIT1 基因与pJET1.2/平端载体连接的质粒和EGFP-N1 质粒用SalⅠ和EcoRⅠ进行酶切，酶切产物连接，连接子转化涂板，长出菌落后，菌落PCR 筛选出阳性克隆.摇菌，提取质粒;再对质粒进行酶切，电泳拍照如图2.

图1 PCR 扩增后全长GIT1 基因Fig.1 Full-length human cDNA of GIT1 after PCR amplification

图2 克隆载体酶切鉴定(EcoRⅠ+SalⅠ)Fig.2 Identification of the enzyme digestion of the expression vector(EcoRⅠ+SalⅠ)

目的基因和载体大小均完全正确，将已经构建好的pEGFP-GIT1 质粒送上海生工公司测序，测序结果完全正确.

2.2 免疫印迹和免疫沉淀检测相关蛋白之间的相互作用结果

正常CHO 细胞均含有GIT1、Paxillin、PIX 基因及表达蛋白，培养3 组细胞后，作者直接以抗GIT1 的单克隆抗体与细胞裂解液免疫共沉淀，用抗GIT1 或抗paxillin 和抗PIX 的单抗在分子成像系统上直接检测的western blotting 试验表明(图3)，GIT1 与Paxillin、PIX，在活细胞中均存在强烈的相互作用，由此作者证实了在CHO 细胞中GIT1、Paxillin、PIX 三者可以三元复合体形式存在于细胞中.

图3 GIT1、paxillin、PIX 蛋白相互作用的western blotting 检测Fig.3 Western blotting of the interaction between GIT1 and paxillin or PIX

2.3 免疫荧光检测蛋白之间相互作用的可以发生在细胞前沿

通过免疫印迹实验作者证实了，GIT1 与Paxillin、PIX 在活细胞中均存在强烈的相互作用，但它们能否以三元复合体形式存在于细胞前沿呢?作者利用人纤粘蛋白(Human fibronectin，hFN)诱导CHO 细胞快速贴壁生长，细胞长势良好，将质粒pEGFP-GIT1 转染CHO 细胞，24～36 h 后，荧光显微镜下拍照，可以看到转染后偶联了绿色荧光蛋白EGFP 的GIT1 蛋白，再分别选用Paxillin 和PIX 的一抗通过免疫荧光检测(图4).A1转染的为pEGFP-GIT1 质粒，A2 为Anti-Paxillin 孵育后的免疫荧光图片，A3 为A1、A2 的叠加图片.B1 转染的为GIT1-EGFP 质粒，B2 为Anti-PIX 孵育后的免疫荧光图片，B3 为B1、B2 的叠加图片.从图A3 可以明显看出Paxillin 与GIT1 具有强烈的相互作用，且这种相互作用可以发生于细胞前沿或细胞尾部.同理，通过图B3 可看出GIT1 与PIX 的相互作用也可以出现在细胞前沿、细胞尾部或细胞两侧.

图4 荧光双定位试验Fig.4 Fluorescent co-localization assay

这表明在细胞前沿，确实存在Paxillin 与GIT1，GIT1 与PIX 的相互作用，由此Paxillin-GIT1-PIX 能以三元复合体形式存在于细胞前沿.

2.4 Rac 蛋白的激活实验

在纤粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 聚集成簇，α4 胞内区域磷酸化而抑制其与Paxillin 结合时，Paxillin、GIT1 与PIX、PAK 形成信号分子复合物.免疫印迹和免疫荧光已证实了Paxillin-GIT1-PIX 能以三元复合体形式存在于细胞前沿，为确认在纤粘蛋白的刺激下，激活的整合素α4 能否诱导Rac 蛋白处于激活状态(GTP-bound)，作者将细胞裂解液与PAK 琼脂糖珠共孵育.如果Rac 蛋白处于激活状态，就能与PAK 蛋白结合.聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以抗Rac 单抗在分子成像系统上直接检测.结果表明(图5)，上样的两种蛋白量基本相同，在纤粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 诱导部分Rac 蛋白处于激活状态(GTPbound)，而在无纤粘蛋白刺激的细胞裂解液中，没有检测到激活的Rac 蛋白.

图5 Rac 蛋白激活试验Fig.5 Rac activation assay

3 讨论

Nishiya 等［5］的研究开启了整合素通过调控Rac 激活而调控细胞极性形成的研究领域.细胞骨架蛋白paxillin 通过其不同结构域，与整合素和其他粘附分子结合，是粘附斑转换的关键调控因素［6］.由于其他整合素，如αIIbβ3、α5β1 等的α 胞内区域通常不与paxillin 结合，在细胞尾部、两侧，由整合素α4 的胞内尾部与骨架蛋白paxillin 联结，paxillin 通过其LD4 结构域与GIT1 结合，形成α4 的胞内区域-paxillin-GIT1 的信号分子复合物［7-8］.GIT1(G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1)为一涉及多个细胞过程且具多蛋白结合域的基因，常定位于胞质复合物、粘附斑和细胞前沿［9-10］，可与Arf、Rac 或Cdc42 的下游效应分子PAK(P21-activatedkinase)、Rac 的转换因子PIX(PAK-interacting exchange factor)相互作用［11-13］.尽管已经证实，paxillin、GIT1 与PIX 之间存在相互作用，但作者的荧光双定位和免疫印迹实验是要验证在CHO 活细胞中，GIT1 与paxillin 或PIX 不仅存在相互作用，且这种相互作用可以发生在细胞前沿.免疫印迹实验表明，GIT1与Paxillin、PIX 存在强烈的相互作用，荧光双定位表明这种相互作用主要发生在细胞尾部或细胞前沿.这证实了在细胞前沿可以存在paxillin-GIT1-PIX 至Rac 的信号转导通路.Rac 蛋白的激活实验表明，在纤粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 诱导的该信号转导通路可使Rac 蛋白处于激活状态(GTP-bound).下一步，作者将采用本实验室开发的FRET 单分子探针，在confocal 下实现高时空分辨率的可视、实时、定量地追踪胞内局部、瞬时的FRET 信号，以揭示活细胞中诱导激活的Rac 从失活到激活状态的时空变化图像［4］.

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