HIF-1—低氧与固有免疫的联系者

沙继斌

(1. 山东体育学院基础理论系，济南 250102； 2. 西安交通大学生命科学与技术学院，西安 710049 )

人体是一个多种调节机制与调节网络并存的复杂生物体,研究已经证实运动应激越强烈，则细胞所生成的活性氧数目越多[1]。大强度剧烈运动在造成机体能量和能源物质大量消耗的同时必然产生大量的活性氧，这种作用的积累将对人体带来深刻的影响。

1 HIF-1是细胞低氧应答反应的核心分子

人们对低氧作用的研究,先后经历了由经典低氧效应到促红细胞生成素(EPO) ,由EPO 到低氧诱导因子1(HIF-1) ,由HIF-1到氧感受器如脯氨酰羟化酶、天冬酰胺酰羟化酶的过程[2]。HIF-1在细胞缺氧应答反应居于核心地位[3]，其包括HIF-1α与HIF-1β两个亚基，其中HIF-1β又称芳香烃受体核转位因子，而HIF-1α只有在低氧浓度下才会被检测到，当氧充足时，HIF-1α即通过一个泛素-蛋白酶通路水解掉，当其氧依赖降解区功能被抑制之后，α亚基即趋于稳定。HIF-1α通常在稳定后移位入核，与配体芳香烃受体核转位因子结合，而后通过与低氧应答元件的5′端增强子序列结合而后激活其它特定的基因,可有效调节细胞、组织、器官不同水平的缺氧应答反应以维持氧稳态。在哺乳动物体内吸入气体与组织细胞之间始终存在氧气浓度梯度差，且不同组织之间差异非常大，由此使不同组织细胞对氧分压浓度梯度产生了广泛的适应。

低氧反应是由周围环境氧气减少诱发的古老的应激反应，一般认为由HIF-1来控制这个过程[4,5]。研究结果表明HIF1广泛参与低氧诱导基因表达的通路，并可受肿瘤抑制基因VHL与血管内皮生长因子VEGF等因子的调节。

2 固有免疫与NF-κB

固有免疫是机体抵御外来的细菌、病毒及其它有害病原体的古老应激反应，是维系组织稳态及正常生命的必备先决条件[6]。固有免疫应答受到核转录因子NF-κB的调控，NF-κB是一类容易二聚化的蛋白，在其活性抑制蛋白被泛素化降解后，移位入细胞核与相应的DNA应答元件结合，接下来通过对靶基因转录调节调控效应分子如抗菌肽的表达。氧化应激可激活细胞的NF-κB信号通路，活性氧基团可激活使IκB上的19、23位丝氨酸磷酸化的激酶，进而使p50与p65二聚体移位至细胞核并与靶基因启动段κB结合激活转录，也就是说细胞的氧化状态直接影响到NF-κB的激活[1,7]。

3 炎症应答——低氧与固有免疫的可能交叉点

研究证实氧合作用与机体免疫力密切相关，在健康人体中，血液中的髓源性细胞要相继经历肺泡毛细血管(氧分压约100mmHg)、混合静脉血(氧分压约40mmHg)、静脉毛细血管(氧分压与组织利用率相关)、淋巴器官(氧分压约4mmHg)的不同环境而产生相应的代谢性适应。这些不断变化的氧合条件会使得包括巨噬细胞在内的固有免疫髓源性效应细胞的行为发生相应的调整，氧气的利用率是调节参与机体免疫防御细胞机能的重要信号[8]，HIF对免疫细胞的有效调节使其能够很好地适应不同区域的氧分压的条件变化。

如上所述，固有免疫系统的髓源性细胞在正常情况下都处于静息状态，而活性氧诱发的细胞结构完整性损伤可导致髓源性细胞的激活，进而引发炎症反应[6， 8]。受损伤组织区域髓源性细胞的趋化性募集会导致血管通透性增加，由此随着局部血流增加而产生炎症反应的经典特征即：红、热、肿、痛与功能障碍。固有免疫系统的效应细胞具有维持可变微环境的生命力及正常功能的作用，据此我们认为炎症反应可能是低氧与固有免疫的交叉点之一。在机体被感染之后，机体会随即产生相应的免疫应答[8]。固有免疫系统中主要效应细胞是多型核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)，多型核白细胞通过氧依赖性以及非氧依赖性的两方面抗菌系统来发现、识别、吞噬、最终消灭入侵的病原微生物[6， 9]。 PMN细胞数目的减少意味着机体免疫机能抑制或者说被感染的危险性增加。

4 HIF-1α是髓源性细胞机能的核心调节者

4.1 HIF-1α对NF-κB的影响

HIF-1不仅仅是细胞能量平衡稳态及细胞对低氧适应的主要调节者。HIF-1同样可以激活细胞抗病原微生物的活性，有效支持巨噬细胞及上皮化细胞的固有免疫应答。已有数据证实HIF-1是巨噬细胞、粒细胞、上皮细胞固有免疫活性及炎症反应的主要调节者，它可以诱导参与炎症反应的基因诸如IL-1β、IL-8、TNFα、iNOS及阳离子抗菌肽cathelicidin的转录，其激活对宿主的防御机能及对细菌感染的应答均有显著影响[7-10]。胞外捕获是近年来所发现的除吞噬作用、分泌可溶性抗菌分子之外的髓源性细胞固有免疫应答方式[11]，其调节因子尚不够清楚，Nizet教授课题组近期发现低氧诱导因子α可有效促进肥大细胞胞外捕获作用,反之如阻断HIF-1的活性，则肥大细胞胞外捕获能力下降[12]。以上结果提示HIF-1可通过化学信号诱导以及生物物理学作用对固有免疫应答机能进行调解。

髓源性细胞对抗入侵病原微生物的场所主要是在感染组织的缺氧微环境中进行，目前已有越来越多的证据证实HIF-1α增强髓源性细胞的抗菌活性，并且可以提高树突状细胞、肥大细胞、上皮细胞的固有免疫机能[6]。Peyssonnaux 等发现低氧诱导因子HIF-1α可有效调节与机体免疫相关的PMN的机能，包括影响阳离子抗菌多肽的转录及影响一氧化氮合酶的合成[13]。Victor Nizet的研究结果提示如果把髓源性细胞中的HIF-1遗传性灭活，在向小鼠体内注射脂多糖后，动物的降压反应、降温反应都有所下降，存活率提高[14]。Cramer等建立了髓源性细胞HIF-1α选择性基因敲除技术，结果发现HIF-1α被选择性敲除后会直接影响到中性粒细胞的杀菌效价与巨噬细胞的迁移[15]。为分析HIF-1α对炎症应答的作用，研究者建立了选择性敲除HIF-1α、血管发生靶基因VEGF、肿瘤抑制因子VHL的实验模型，结果发现HIF-1α的缺失导致低氧应答基因VEGF的活性基本完全丧失，并且使两个与葡萄糖代谢相关的关键酶葡萄糖转运因子1和磷酸甘油酸酯激酶的活性受到抑制。在HIF-1α缺失的巨噬细胞中，我们同样观察到了在常氧条件下这3种基因的表达水平显著下降。这种HIF-1α的条件性缺失会显著抑制炎症应答，由此我们认为髓源性细胞功能具有HIF-1α依赖性，如缺少HIF-1α，其机能受到显著抑制[16]。在Cramer以及Peyssonnaux的试验中，我们发现转录因子HIF-1α对于机体炎症应答以及巨噬细胞、中性粒细胞的活性具有很好的促进作用。研究发现，在巨噬细胞及中性粒细胞中，HIF-1α可以被Gram(+)及Gram(-)细菌诱导，这种诱导作用与组织氧合程度无关[13， 15]。

在100年前探索糖酵解供能在炎症细胞能量产生中的作用时已有研究者关注到了无氧糖代谢对免疫细胞功能的重要性。在低氧条件下，基本上所有与糖酵解相关的酶活性都有所上调，这种上调作用均通过HIF-1α来实现。在HIF-1α突变的小鼠中，巨噬细胞与中性粒细胞内的ATP水平都显著下降15%～20%，野生型的甚至下降40%。这种ATP水平的下降与2-脱氧葡萄糖引起的ATP减少相似，这说明HIF-1α对于髓源性细胞的糖酵解能量调节具有重要作用[15]。由此可见， HIF-1α在与病原微生物接触后随即被激活而后调节吞噬细胞的固有免疫机能。我们发现HIF-1α的增效剂含羞草碱可以增强人体吞噬细胞的活性，可以提高杀灭金黄色葡萄球菌的能力[17]，这种作用具有剂量依赖性。含羞草碱可以有效的减小在鼠类动物皮肤上以金葡菌制备的皮肤感染创面的面积，促进创面愈合。新发现的一类HIF-1的稳定剂AKB-4924自身并没有直接抑杀细菌作用，但可以通过提高胞内HIF-1的水平及增强巨噬细胞与上皮细胞的抗菌活性，有效抑杀对甲氧西林敏感的金葡菌及具有甲氧西林抗性的金葡菌，可以有效提高上皮细胞及巨噬细胞的抗菌活性，其作用超过含羞草碱[18]。

图1 不同氧分压条件下HIF-1表达并于NF-κB相互作用示意图[3]

4.2 HIF-1与抗菌肽表达

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是固有免疫系统的重要成分之一,具有直接抑杀病原微生物与针对宿主进行免疫调节的双重作用[6]。在HIF-1被选择性敲除的角质细胞当中，cathelicidin的分泌显著减少，而坏死区域皮肤金黄色葡萄球菌的数量增加，反之，如果与HIF-1结合的肿瘤抑制蛋白VHL缺失的话，cathelicidin的分泌增加，金黄色葡萄球菌的感染率下降,以上结果提示HIF-1对于抗菌肽的产生有直接调节作用[19]。

5 核转录因子NF-κB可能是低氧与固有免疫的重要联系者

固有免疫应答受若干转录因子调节，核转录因子κB是其中的关键因子之一。NF-κB的活性主要受IKK-β的调控，IKK-β通过调控IκB磷酸化降解以控制NF-κB的活性。转录因子NF-κB与其激活激酶IKK-β是重要的炎症反应因子，也是固有免疫应答的必需因子，如不考虑其免疫抑制效应，药理性阻断IKKβ-NF-κB通路可作为炎症的治疗策略。

在低氧培养的细胞中IKK-β可被适度激活，而脯氨酰羟化酶可抑制其激活，而氧气浓度依赖的脯氨酰羟化酶又是HIF-1α的重要稳定因子，这提示NF-κB与HIF-1之间可能存在密切联系。选用IKK-β敲除的小鼠作为实验对象，结果发现NF-κB是HIF-1α必不可少的转录激活因子，在低氧培养的细胞中及低氧动物的肝脏与脑组织中都必须保有一定NF-κB的活性才能保持HIF-1蛋白的水平[7]。IKK-β基因的缺失会导致HIF-1α靶基因如血管内皮生长因子基因诱导失败，在对抗细菌感染的巨噬细胞中，HIF-1蛋白的积累同样需要IKK-β的参与，由此可见IKK-β是低氧应答的重要调节因子，可以使之与固有免疫及炎症应答联系起来[7]。同时发现在诱导性IKK-β缺失的小鼠中会出现中性粒细胞增多，如果把IKK-β缺乏小鼠中的白介素1受体(IL-1R)清除掉，其血细胞构成趋于正常并可避免中性粒细胞引发炎症，但与之同时其对细菌易感性大大增加[20]。由此表明炎症反应与机体固有免疫机能之间既存在密切联系，又可能存在一定矛盾。有研究表明如果选择性敲除髓源性细胞中的HIF-1，则可引起致炎因子的水平升高并可提高动物的生存率，这种致炎因子水平的升高与IKK-β对NF-κB的激活有关[16]。

目前尚难于定论HIF-1与NF-κB之间的调控关系，在离体系统当中，研究者发现HIF-α可激活NF-κB，NF-κB则可调节HIF-1的转录。亦有研究认为HIF-α的激活可同时伴有NF-κB被抑制[7]。Victor Nizet实验室利用κB抑制蛋白激酶基因敲除小鼠作为动物模型，证实了NF-κB是HIF-1α必不可缺的转录激活因子[21]。在低氧条件下培养的细胞中，κB抑制蛋白激酶的β亚基的活性会有所增加，而脯氨酰羟化酶则可以抑制这种激活作用从而HIF-1的α亚基稳定性增强，也就意味着HIF-1活性的增强。在低氧条件下动物的肝与脑中，NF-κB必须保持一定的活性才能保证HIF-1α的数量[21， 22]。由于κB抑制蛋白激酶的β亚基的缺失，导致诸如血管内皮生长因子之类的HIF-1的靶基因不能受到正常诱导，κB抑制蛋白激酶的β亚基的缺失同样影响到了HIF-1在细菌感染的巨噬细胞中的数量或表达[22]。这些数据表明κB抑制蛋白激酶的β亚基对于低氧反应而言，是一个不可或缺的生理因素，它在低氧应答与固有免疫及炎症过程中，发挥着重要的联系作用[23]。另有研究发现NF-κB可上调HIF-1α的表达，这提示在对抗感染及组织损伤的过程中，固有免疫应答与低氧应答之间可能存在相互的依赖[22]。在κB抑制蛋白激酶β亚基基因敲除的动物模型髓源性细胞中，在低氧条件下HIF-1的表达未见增多，提示NF-κB通路的紊乱对于HIF-1的激活存在直接影响[13,16,21]。

6 小结与展望

上述结果表明在机体低氧应答与固有免疫应答之间存在极为密切的联系，HIF-1及NF-κB在这两个过程中发挥着重要的联系及调节作用。长时间大强度运动导致机体氧供应是公认的事实，而受到低氧应答调节的NF-κB是抗菌肽产生的激活因子,由此以来我们推测运动性低氧对机体抗菌肽表达及固有免疫机能的发挥均可能存在较为深刻的影响。目前运动免疫学的热点集中于运动应激对神经内分泌免疫网络的影响[24]，对上述二者之间的关系尚缺乏研究报道。该领域研究的逐步开展可能为运动性免疫抑制的机理阐释提供很多有趣的事实和数据。

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