NOX及细胞内ROS与胶质瘤增殖及恶性程度的关系

由丽娜 姜海东

脑胶质瘤是神经科中常见的原发性脑内肿瘤，发生率约为颅内肿瘤的40%[1]。近年随着对颅内肿瘤研究的深入，相关研究指出肿瘤细胞内活性氧酶簇(IDO activity clusters，ROS)可作为细胞内信号传导的重要媒介，其可能在肿瘤细胞的增殖及凋亡过程中发挥重要的作用[2]。NAD(P)H氧化酶(NOX)被认为是ROS的来源物质。本文将探讨NOX及细胞中ROS与脑胶质瘤增殖及恶性分级的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取本院2011年1月至2013年1月经病理组织学证实为脑胶质瘤患者48例为研究对象，其中男性27例，女性21例，年龄为3～72岁，平均年龄为(45.6±5.8)岁，病程为2～14个月，平均病程为(6.8±2.7)个月。根据WHO关于神经中枢系统肿瘤的恶性程度分级标准将患者分为Ⅰ级15例，Ⅱ级16例，Ⅲ级10例，Ⅳ级7例。选取同期行脑外伤手术的20例非肿瘤患者的正常脑组织为对照组，其中男性12例，女性8例，年龄为3～74岁，平均年龄为(47.8±3.9)岁。上述各组性别、平均年龄无统计学差异(P>0.05)，具有可比性，且均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 NOX mRNA含量的测定 采用RT-PCR(购于日本TAKAPA公司)测定各组脑组织中NOX mRNA含量，设计针对人NOX的PCR的探针序列以及荧光检测引物，选择人GAPDH(由美国BD公司提供)作为测试的内参物，并采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取RNA，荧光定量PCR实验严格按照试剂盒操作说明进行。NOX mRNA相对表达量=目的基因/内参基因。

1.2.2 脑组织ROS含量测定 采用流式细胞仪测定患者脑部组织ROS含量，将样本组织剪碎后采用D-Hank's试剂液进行冲洗，并加入1 mg/mL的DNASeI以及2.5 g/L胰蛋白酶混合液，并在37℃中孵化30～60 min，并在含有小牛血清的DMEM培养基中终止消化。样液反复吹打后过滤弃上清液，并用D-Hank's试剂洗涤2次，再次离心5 min，去上清液，留置沉淀物，加入DMEM将悬浮液浓度为2×106/mL的细胞悬液，并于37℃中避光放置，并采用流式细胞仪检测其荧光强度。ROS含量采用相对荧光强度表示：实验测得平均荧光强度/对照组平均荧光强度。

1.2.3 免疫组化法测定脑胶质瘤组织NOX表达 将患者脑部组织标本切成4～8 μm的冰冻切片，室温下静置30 min，加入4°C丙酮固定10 min，用PBS洗涤3次，加入过氧化氢消除内源性过氧化物活性，采用PBS洗涤3次，5 min/次，加入兔抗人NOX一抗，并在室温下孵化2 h后用PBS漂洗，随后加入1∶500的FITC标记的羊抗兔IgG，并在室温下避光孵育30 min，用PBS漂洗，并在荧光显微镜下观察NOX表达情况。

1.2.4 免疫组化法阳性结果判断 ①在倍数为100的显微镜下观察细胞着色情况，根据着色程度由轻至重可分别记为0、1、2、3；②随机选取5个视野点，采用倍数为400的显微镜分别对5个视野进行观察，每个视野进行细胞计数，并计算细胞的阳性百分比(以500个细胞作为1组计算单位)，细胞阳性百分率：<10%为1分,10%～50%为2分,>50%为3分。积分计算：①与②计算所得的分值相乘，积分0分为阴性“-”，1～3分为弱阳性“+”，4～6分为中度阳性“++”，7～9分为强阳性“+++”[3]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RT-PCR检测脑组织NOX mRNA表达

与正常脑组织相比，脑胶质瘤细胞组织中NOX1～5 mRNA的含量显著增加，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，具体结果见表1。

表1 RT-PCR检测脑组织NOX mRNA相对表达量

2.2 脑胶质瘤组织ROS含量测定

经单因素分析，NOX表达量与ROS的含量呈正相关(γ=0.698，P=0.001)。随着脑胶质瘤分级的增加，脑胶质瘤细胞组织中ROS的含量显著增加，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 NOX在脑胶质瘤组织中的表达情况

随着病理分级水平的增加，NOX表达阳性率显著增加，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 流式细胞仪测定脑组织ROS含量±s)

表3 免疫组化法检测NOX在脑胶质瘤组织中的表达情况(例，%)

3 讨论

相关研究指出[4]，ROS属于细胞内部的信号转导因子，对细胞基因转录、增殖、凋亡起到重要的调控作用。构成ROS酶体包括NOX、脂氧化酶、黄嘌呤氧化酶、环氧合酶、线粒体呼吸链以及不偶联一氧化氮合酶，其中NOX被认为是细胞内ROS的主要来源。

当机体在正常状态下，NOX则能保持一定的活性并产生ROS，在正常生理情况下ROS的表达处在低水平，其生命活性受到抑制。通过此途径产生的ROS其生理作用主要是作为第二信使对信号传导的介质如转录因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶等物质产生作用，从而调控信号传导[5]。同时ROS还能参与到多器官的生理功能调控中，对维持机体正常的生命活动起到重要的作用。当机体受到外界刺激时会激活NOX产生大量的ROS，从而诱导机体出现各种疾病[6]。研究表明[7]，脑组织中ROS主要参与到肿瘤的发生及发展中，当细胞中ROS浓度过高时会导致细胞内DNA出现损伤，从而导致DNA出现突变，引发肿瘤的产生；此外高浓度的ROS会导致细胞出现异常增殖，并能诱导低氧因子以及血管内皮生长因子产生，从而导致肿瘤血管增生，促使肿瘤增殖、转移。

通过本研究发现，48例脑胶质瘤组织样本中均能检出NOX及ROS有不同程度的表达，而在正常的脑组织中NOX及ROS的表达则较低。在不同病理级别的胶质瘤中NOX表达存在差异性，随着恶性程度的增高，患者中NOX以及ROS的表达也随之增高。且NOX1～5 mRNA的表达量随着肿瘤级别的增加而显著增加，并且ROS也随之增加。NOX是产生ROS的主要酶体，并且与脑胶质瘤的恶性分级有密切关系。免疫组化法检测NOX在脑部组织的表达情况，发现随着病理分级水平的增加，NOX表达阳性率显著增加，从而进一步提示，NOX在脑胶质瘤的发展过程中起到重要的作用。

目前对于脑胶质瘤的治疗效果并不理想，传统的放化疗以及手术治疗后容易出现复发，这可能与NOX表达的上调以及产生的ROS调控脑胶质瘤基因表达、增殖以及凋亡有密切关系[8]。本研究也证实了在脑胶质瘤中NOX具有较高的表达能力，经单因素分析，NOX表达量与ROS的含量呈正相关(γ=0.698，P=0.001)，其原因可能与NADPH氧化酶DPI抑制NOX活性，进而清除细胞内ROS，减少肿瘤复发有关，因此通过抑制NOX的产生可作为治疗脑胶质瘤的新型治疗手段。但对于NOX在脑胶质瘤中的具体表达机制、活性调控机制以及亚单位结构的相互作用还需要进一步进行研究。

[1] 向定朝.胶质瘤化疗耐药细胞与胶质瘤干细胞的关系〔J〕.实用癌症杂志,2012,27(4):423.

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[3] 周开甲,张 鸣,刘伯伟.Ki-67、p53在脑胶质瘤中的表达及意义〔J〕.实用癌症杂志,2012,27(6):572.

[4] 周金桥,王景涛,刘秋红,等.人脑星形胶质细胞瘤恶性程度相关蛋白表达谱的分析与鉴定〔J〕.中华神经医学杂志,2012,11(8):780.

[5] 卢灿亮,黄品助,李斌奎,等.NADPH氧化酶DUOX1在肝细胞癌中的表达及临床意义〔J〕.中华普通外科学文献：电子版,2010,4(1):10.

[6] 张发兵,柯以铨,姜晓丹,等.NADPH氧化酶调节U251胶质瘤细胞的生长和凋亡〔J〕.中华神经医学杂志,2010,9(4):345.

[7] EI Hellene S,Boisselier B,Peglion F.A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization:tubular vasculogenic mimicry 〔J〕.Brain,2010,133(Pt4):973.

[8] 韩晓燕.NADPH氧化酶NOX家族与疾病的关系〔J〕.国际病理科学与临床杂志,2010,30(6):513.